鸡传染性法氏囊病双抗体夹心Dot─ELISA诊断法的建立及应用

以醋酸纤维素膜作为固相载体，辣根过氧化物酶标记鸡抗传染性法氏囊病病毒抗体（ＩＢＤ—ＩｇＧ），饱和二氨基联苯胺为底物显色，建立了鸡传染性法氏囊病双抗体夹心Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ诊断法。经方阵实验确定最佳反应条件为：ＩｇＧ的包被液为０．０５ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ９．６）碳酸盐缓冲液，包被浓度为１：５０；酶标抗体的工作浓度为１：１００；洗涤液为含０．０５％吐温—８０的０．０２ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）磷酸盐缓冲液；封闭液为含０．２％明胶的洗涤液；封闭时间、抗原及酶标抗体的作用时间均为３７℃３０ｍｉｎ。应用本方法和琼扩试验同步检测２０份已知阳性病料、１２０份待检病料和胚毒尿囊液、１０份正常鸡样品，结果表明，Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ阳性率为９０％，而琼扩试验为４０％；凡琼扩试验阳性者，Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ均呈强阳性，而在Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ阳性样品中，只有４４％呈琼扩试验阳性，Ｄｏｔ—ＥＬＩＳＡ的敏感度为琼扩试验的１００倍。     

ELISA检测3种禽多杀性巴氏杆菌抗原的比较

关于检测禽多杀性巴氏杆菌血清抗体的研究,国外学者是应用凝集反应、间接血凝、酶联免疫吸附试验。研究认为,ＥＬＩＳＡ具有敏感性和可重复性等优点,是理想的血清学检测方法。在应用ＥＬＩＳＡ检测禽多杀性巴氏杆菌抗体的时候,如同其它血清学方法一样,抗原提取及钝化...     

检测减蛋综合征抗体间接ELISA法的建立及应用

用蔗糖不连续梯度纯化的减蛋综合征＊（ＥＤＳ－７６）病毒包被ＥＬＩＳＡ板，建立了检测ＥＤＳ－７６抗体的间接ＥＬＩＳＡ法。经测定，抗原最适包被浓度为１μｇ／ｍＬ，待检血清最佳稀释度为１：２００，以ＯＤ４９０〉０．３，Ｐ／Ｎ〉２．１判为阳性结果。对４个鸡场的１２０份鸡血清进行检测，阳性率分别为０，４３．３３％，８０．００％和９３．３３％。     

现地马传贫琼扩阴性 酶联免疫法阳性病马血清的特异性试验

在内蒙古牙克石市图里河镇非马传贫注苗区，用琼脂扩散试验（ＩＤ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）两种方法对６４匹马进行了对比检查，检出ＩＤ、ＥＬＩＳＡ双阳性４匹、ＤＬＩＳＡ单阳性马３匹。对３匹ＩＤ阴性，ＥＬＩＳＡ阳性马血清用不同浓度琼扩抗原重复检测结果为阴性，而用不同批次的ＥＬＩＳＡ抗原包被板及酶标抗体检测结果均为陧阳性，用马传盆病毒抗原对３匹单阳性马血清中和后，再进行ＥＬＩＳＡ测定，ＯＤ值均降低５     

禽多杀性巴氏杆菌ELISA三种抗原比较研究

禽多杀性巴氏杆菌ＥＬＩＳＡ三种抗原比较研究刘云同郑星道金仁哲顾万钧黄伟（吉林省通化县家畜繁改站·１３４１００）（吉林农业大学动物科学系关于检测禽多杀性巴氏杆菌血清抗体的研究，国外学者是应用凝集反应、间接血凝、酶联免疫吸附试验检测禽多杀性巴氏杆菌弱毒免...     

家兔黄艾美耳球虫血清抗体ELISA检测法的建立

应用制备的孢子化卵囊可溶性抗原作了包被抗原建立了兔球虫血清抗体的ＥＬＩＳＡ检测法。其最适条件为：抗原包被浓度，２００μｇ／ｍＬ；包被温度，３７℃（２ｈ）；血清反应时间，１．５ｈ；酶标抗体标准工作浓度，１：１０００；反应时间，１ｈ待检血清稀释度，１：１００：ＥＬＩＳＡ试验的规定吸收值为０．０６，孢子化卵囊可溶性抗原比非孢子化卵囊可溶性抗源更适于作为ＥＬＩＳＡ包被抗原。     

Dot—ELISA检测猪生殖和呼吸综合征抗体的研究

用差速离心法提纯ＰＲＲＳ病毒，利用ＮＣ膜作为载体，在国内外首次成功建立了检测ＰＲＲＳ血清抗体的斑点酶联免疫吸附试验（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）。抗原包被浓度为１００μｇ／ｍｌ，被检血清工作浓度为１：１０，酶标兔抗猪ＩｇＧ工作浓度为１：６００。对７２份北京地区猪血清分别用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和ＩＦ检测，Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ检测阳性率为３３．３％，ＩＦ检测阳履率为３０．６％，与ＩＦ符合率较高，对部分待检血清检测     

禽多杀性巴氏杆菌保护性荚膜抗原基因PCA_（10）的高效表达及其免疫原性

以ＰｓｔＩ酶切含禽多杀性巴氏杆菌保护性荚膜抗原基因片段ＰＣＡ１０的重组质粒ｒＰＣＡ１０，收集基因片段ＰＣＡ１０，经修饰后依次连接到系列高效表达载体ＰＥＶ—Ｖｒｆ１～３的ＢａｍＨＩ切点上，转化至Ｅ．ｃｏｌｉＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ｃＩｔｓ）中。经快速检测，这３种载体的重组子中均有ＰＣＡ１０插入。以间接ＥＬＩｓＡ检测重组子转化菌，只有ＰＥＶ—Ｖｒ１３载体的重组子转化菌与禽巴氏杆菌保护性荚膜抗原（ＰＣＡ）抗血清呈阳性反应，且ＯＤ值为原克隆菌株ｒＰＣＡ１０的３倍，初步证明ＰＣ１０已克隆至高效表达载体ＰＥＶ—Ｖｒｆ３上，而且读码框架正确。用ＥＬＩｓＡ阳性表达克隆株ＰｃＡ７１—Ｖｒｆ３免疫小鼠和鸡，均达到７０％的保护率。     

VP_7-ELISA检测牛、羊血清蓝舌病抗体的研究Ⅱ应用VP_7-ELISA检测蓝舌病抗体

蓝舌病ＶＰ７抗原包被板在－２０℃保存期为６个月,４℃保存１个月。抗原批内重复性试验ＣＶ＜１０％,批间重复性试验ＣＶ＜１０％。ＶＰ７－ＥＬＩＳＡ与ＡＧＩＤ对４２０份血清平行检测结果：ＶＰ７－ＥＬＩＳＡ较ＡＧＩＤ试验多检出了 １３份阳性样品, ＶＰ,－ＥＬＩＳＡ检出的阳性样品对ＡＧＩＤ阳性样品的覆盖率为９７．４％,对采自陕西等省１８１６份牛、羊血清样品进行检测,检出阳性样品数为２５７份阳性检出率为１４．２％。     

非洲猪瘟间接ELISA诊断试剂盒的研究

用带有编码非洲猪瘟病毒衣壳蛋白Ｐ７２ 基因的重组杆状病毒（Ｂａｃｐ７２）作载体,在ｓｆ９细胞中表达并得到重组Ｐ７２蛋白,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ可得到分子量在 ７２ｋＤａ左右的电泳带。用标准阳性非洲猪瘟血清对 Ｐ７２蛋白进行 ＥＬＩＳＡ检测,证明该蛋白具有生物学活性。用Ｐ７２作为间接法的包被抗原,对ＥＬＩＳＡ反应条件进行了优化。确定最佳包被液为ＰＢＳ（ｐＨ７．２）、最佳封闭液为１％ＰＣＴ、最佳血清稀释液为４％ＰＥＧ６０００／ＰＢＳ、最佳冲洗液为０．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ（ｐＨ７．２）。本实验反应体系采用５０μｌ的微量法,可节约试剂及抗原。反应在２小时内即可完成,达到了快速诊断的目的。包被了抗原并用封闭液封闭后的酶标板密封后保存于－２０℃的冰箱中,至少可以保存５个月。阻断试验和交叉试验表明ＥＬＩＳＡ法有良好的特异性。间接ＥＬＩＳＡ比Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法具有更高的灵敏性。血清学调查没有得到阳性结果,与我国实际情况相符。用Ｂａｃｐ７２表达的非洲猪瘟病毒Ｐ７２蛋白抗原作为间接ＥＬＩＳＡ的检测抗原来检测非洲猪瘟血清具有快速、简单、无感染的特点。本实验为非洲猪瘟ＥＬＩＳＡ检测试剂盒的最终组装提供了实验依据。     

猪源多杀性巴氏杆菌C44—48（A型）的鉴定

对猪巴氏杆菌二价灭活疫苗生产菌株之一的Ｃ４４－４８菌株进行了鉴定，结果菌体形态，生化特性，菌落特征，血清学特性均符合多杀性巴氏杆菌的特性。菌种毒力为皮下３ＣＦＵ活菌可致死家兔，皮下３３０ＣＦＵ可致死仔猪。以５批Ｃ４４－４８疫苗用家兔和仔猪效检，结果均合格，表明免疫原性良好。保存期试验结果表明浆干菌种在０－８℃保存至少可达６年。用家兔进行交互免疫试验，结果表明，相同血清群菌株保护７５－１００％；不同     

禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白载体抗原的研究

用EDC法和CNBr法分别交联禽巴氏杆菌荚膜多糖(CPS)与破伤风类毒素(TT),经Sephadex-G150柱层析和薄层层析鉴定表明;两种方法均获得一种大分子的CPS-TT结合物,该结合物免疫鸡的血清经二巯基乙醇(2-ME)处理后用间接血凝试验(IHA)检测出较高滴度的IgG抗体和一定量的IgM抗体,抗体消长情况监测结果;IgG抗体的峰值(4.88)在免疫后第21天,其后缓慢下降,持续至第24周左右。IgM抗体的峰值(4.26)在第14天,其后陡降,至第8周降至阴性血清水平,与对照组差异极显著(P<0.01)。第8周和第24周时测出较强的二次反应和回忆反应。重复试验测出的IgG、IgM抗体滴度与本试验结果相近,第4周时攻毒保护率分别为100％和75％,且IgG抗体滴度与攻毒保护率的相关性较好,1:16以上可获得全保护。试验结果表明交联方法稳定,重复性较好,制备的CPS-TT载体抗原实现了CPS由Ti抗原向Td抗原的转换。为研究一种新型的禽霍乱载体菌苗提供了理论依据和实验手段。     

从实验感染鸡血液中最大量提取巴氏杆菌试验

通过对AA鸡不同途径攻毒及不同时间不同途径的采血试验,结果表明:通过翅静脉攻毒,在鸡濒死挣扎时的即刻颈静脉无菌放血,再通过差速和蔗糖密度梯度离心,可以从攻毒鸡的血液中提取到最大量的体内培养的巴氏杆菌。用这样的方法,每只鸡可提取到约300～400亿菌,比以前用的方法提高1000倍以上。提取的细菌灭活后免疫鸡,经异型菌交叉攻毒试验,结果表明体内繁殖的巴氏杆菌具有交叉保护特性。     

兔巴氏杆菌耐药性分析

对临床分离的36株兔巴氏杆菌,按照Kirby-Bauer药敏纸片法进行了22种抗菌药物的耐药性实验.结果:兔巴氏杆菌耐药性比较严重,而且多数为多重耐药,对临床常用的药物(如喹诺酮类、庆大霉素、卡那霉素、磺胺类药物等)多数产生了不同程度的耐药性,同时发现对青霉素类、氟苯尼考以及利福平敏感性较高.     

大灰袋鼠多杀性巴氏杆菌的分离与鉴定

2010年5月,北京动物园饲养的1只大灰袋鼠急性死亡。解剖发现其胰腺、心肌、大网膜、肾上腺等大面积出血。无菌采集肝、脾、大网膜接种于血琼脂培养基,分离到一株细菌。对细菌纯培养物进行形态学观察,并分别做氧化酶、触酶、糖发酵等生化特性试验,初步判定为多杀性巴氏杆菌。同时,API鉴定系统显示,该菌为氧化酶阳性、触酶阳性。API20E鉴定试纸鉴定为多杀性巴氏杆菌,鉴定百分率为90%。用该菌的培养物对6只小白鼠做致病性试验。6只小鼠均于6 h内死亡,经剖检均从心血中分离到较纯的多杀性巴氏杆菌。进一步说明分离到的菌株为多杀性巴氏杆菌。     

An abattoir survey of pneumonia and pleuritis in slaughter weight swine from 9 selected herds. IV. Bacteriological findings in chronic pneumonic lesions.

A total of 855 pig lungs were collected at slaughter and evaluated macroscopically. Bacteriological examinations were carried out on tissue samples from chronic pleuropneumonic lesions (n = 196) and from chronic bronchopneumonic lesions with suppuration (n = 14). Samples from normal lung tissue (n = 22) were also included. Pasteurella multocida was isolated from 54%, Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae from 11%, and Streptococcus spp. from 14% of the pneumonic lesions, respectively. From normal lung tissue P. multocida was isolated from 3 (14%) of the samples, A. pleuropneumoniae was not recovered and streptococci were isolated from only 1 (5%) of these samples. The above mentioned bacterial species were recovered either in pure cultures or mixed with various other microbes. A total of 109 P. multocida strains were further characterized by capsular serotyping and testing for production of dermonecrotic toxin. Ninety-nine (91%) of the strains were capsular type A 10 (9%) were type D. Out of the type A and the type D strains 94% and 90% were toxigenic, respectively. Most of the A. pleuropneumoniae strains were serotype 2. Strains of serotypes 1 and 7 were also identified. The majority of the streptococci were identified as either Streptococcus suis or Streptococcus dysgalactiae. Actinomyces pyogenes was isolated from 14% of the lesions and anaerobic bacteria from 18%, respectively. The significance of the various bacterial species in relation to the development of chronic pneumonic lesions is discussed. Special attention is paid to P. multocida, and it is concluded that this bacterial species is probably of importance for the development of both types of chronic pneumonias.     

猪多杀性巴氏杆菌病预防与临床诊治

猪巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的,又叫猪肺疫或俗称“锁喉风”。其主要临床表现为呼吸困难、发热、咽喉炎、肺炎和出血性败血症。该病的死亡率较高,给我国养猪业带来巨大经济损失。文章主要对猪巴氏杆菌的病原、流行特点、病理变化、临床症状、诊断以及防治进行剖析,进而给出科学的治疗方法,对防控猪巴氏杆菌病提供参考。     

Adherence of Pasteurella multocida to fibronectin

For many pathogens, adherence and/or invasion involve association with host extracellular matrix molecules, such as fibronectin (Fn). Pasteurella multocida was found to bind significantly to Fn and collagen type IX but not to laminin and collagen types IV and X. The binding of P. multocida to Fn was dose-dependent and was inhibited by heparin (Hep). Removal of polysaccharide capsule enhanced the binding capacity of the bacterium to Fn and inhibition by Hep. Protease treatment of bacteria decreased binding, implicating surface protein(s) as adhesive components. Investigation of the binding domain(s) of P. multocida on the Fn molecule revealed preferential binding to the N-terminal Hep-binding domain of Fn but not to the carboxyl-terminal Hep-binding domain. Furthermore, Fn, and anti-Fn antibodies inhibited P. multocida adherence to Madin-Darby bovine kidney cells, suggesting the involvement of Fn in the bacterium adherence to host cells. Ligand blotting, batch affinity purification and MALDI-TOF mass spectrometry implicated several proteins as putative adhesins of P. multocida in the Fn-mediated adherence. Taken together, the data suggest that P. multocida-Fn interaction may play a role in the bacterium adherence to host cells, and this may be mediated by bacterial surface proteins with preferential affinity for the Hep-1 binding domain of Fn.     

禽多杀性巴氏杆菌单克隆抗体的制备及其基本性状研究

将多杀性巴氏杆菌（Ｐ．ｍ．）Ｃ４８－１株（Ｈｅｄｄｌｅｓｔｏｎ１型；Ｃａｒｔｅｒ分型５：Ａ）灭活后全菌免疫的ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠脾细胞与ＳＰ／０骨髓瘤细胞在ＰＥＧ１０００作用下融合。用全菌包被的间接ＥＬＩＳＡ方法检测抗体，获得了２３株能稳定分泌抗Ｐ．ｍ．１型单克隆抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞培养２个月和冻存３个月后复苏培养，均能稳定分泌特异性单克隆抗体。２３株腹水ＥＬＩＳＡ效价分别从１０－３—１０－１１，无免疫沉淀性，也无凝集性。Ｉｇ类型鉴定表明，３株属于ＩｇＭ，２０株属于ＩｇＧ。间接ＥＬＩＳＡ检测结果表明：２３株单抗只与Ｐ．ｍ．１型起反应，而不与Ｐ．ｍ．３、４、１６型起反应，也不与禽类易感的鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、李氏杆菌起反应，具有型的特异性。用ＩＣ８Ｈ９腹水建立的夹心ＥＬＩＳＡ方法检定Ｐ．ｍ．１型菌株，其敏感性高，特异性强，也更为方便。     

间接ELISA检测禽多杀性巴氏杆菌抗体中包被抗原的选择

间接ELISA已在抗体检测中广泛应用,而抗原包被作为间接ELISA中必不可少的一步可直接影响试验的准确性。本试验分别使用超声波裂解抗原、脂多糖蛋白抗原和全茵抗原作为包被抗原,建立相应的检测方法并进行重复性试验。试验证明全菌抗原建立的禽多杀性巴氏杆菌ELISA检测方法在敏感度、特异性、稳定性方面均优于其他两种抗原。