微小亚历山大藻amtk-4共附生菌群多样性及其产毒新种Z1-D的sxtA1基因进化研究

藻菌关系是揭示赤潮生消与防控、赤潮毒素产生机制的关键,而产毒甲藻共附生菌群多样性及可培养菌株的获得是解析藻菌关系的前提。微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)是全球性典型赤潮甲藻,其产生的麻痹性贝类毒素(PSP)危害巨大,但目前对其共附生菌群尚缺乏系统性研究。通过高通量测序首次解析了产毒微小亚历山大藻amtk-4共附生菌群的物种种类及相对丰度信息;分离获得可培养菌株并对筛选获得的产毒细菌新种Z1-D的毒素合成基因sxtA1进行了基因进化分析,结果表明,amtk-4共附生菌群包括85个OTU,其中包括10门、20纲、40目、59科及87属。其6个优势属包括Phycisphaeraceae科未知属(11.8%)、Muricauda属(10.3%)、腐螺旋菌科未鉴定属(9.1%)、Hyphomonadaceae科未鉴定属(8.9%)、Haliea属(5.7%)及红细菌科未鉴定属(5.1%)。amtk-4共附生菌群中未鉴定属比例高达53.4%。藻生长稳定期所分离获得的可培养细菌数量及种类最多。5株细菌中菌株Z1-D及Z1-4经分子鉴定分别为亚硫酸杆菌属(Sulfitobacter)及Mesorhizobium属新种。其中Z1-D发酵代谢产物含微量石房蛤毒素(STX),其基因片段orf-01498与蓝藻sxtA1基因高度同源,与产毒蓝藻间可能存在着基因共同进化。     

产麻痹性贝毒塔玛亚历山大藻共培养菌群的物种多样性研究

产毒赤潮藻与其共生菌的互作关系是揭示麻痹性贝毒(PSP)产生机制的关键,而其共培养菌群的分离及其多样性解析是开展此研究的必要前提。塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)是典型产PSP赤潮原因甲藻,为揭示其共培养菌群的物种多样性信息,本文通过免培养海洋微生物高通量测序技术,解析了东海塔玛亚历山大藻(at3#)共培养菌群的种类、丰度及多样性信息。结果表明,其共培养菌群共有87个种与已有数据库匹配,此外尚有5%的未知种。其包含57个属,其中优势菌属5个,分别为Rhodobacteraceae、Marinobacter、Methylophaga、Nitratireductor及Phycisphaera。研究表明东海产PSP塔玛亚历山大藻(at3#)含有物种丰富的共培养菌群,且具有发掘海洋特殊生境微生物新种属的良好潜力。     

利玛原甲藻PL11共附生菌多样性研究

为揭示产腹泻性贝类毒素(diarrheic shellfish poisoning,DSP)典型赤潮甲藻-利玛原甲藻(Prorocentrum lima)PL11的共附生菌群多样性信息,通过Illumina MiSeq高通量测序分析了PL11的共附生菌群种类及相对丰度,并且对其可培养共附生菌株进行了选择性分离及其16S rRNA基因序列扩增与系统发育的分析。利玛原甲藻PL11高通量测序结果显示:样品共附生细菌包括5门,14纲,26目,38科及54属。其中优势门(>5%)为3个,包括变形菌门(Proteobacteria,75.5%)、拟杆菌门(Bacteriodetes,11.5%)以及浮霉菌门(Planctomycetex,8.5%);优势纲(>5%)为4个,包括α-变形菌纲(Alphaproteobacteria,51.7%)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria,31.8%)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria,9.9%)以及OM190纲(8.9%);优势属(>5%)为6个,侏囊菌科下未知属(norank Nannocystaceae,21.8%)、Pyruvatibacte属(11.6%)、Phaeodactylibacter属(9.4%)、生丝单胞菌科下未知属(norank Hyphomonadaceae,8.5%)、OM190纲下未知属(8.1%)以及Roseovarius属(7.9%)。从利玛原甲藻PL11培养物中分离获得可培养微生物菌株9株,分属于8个属,包括Ochrobactrum sp.(2株)及Microbacterium sp.、Algoriphagus sp.、Ponticoccus sp.、Hoeflea sp.、Labrenzia sp.、Sphingopyxis sp.、Erythrobacter sp.各1株。其中PL11-1为Ponticoccus属潜在新种。     

环境因子对链状亚历山大藻生长的影响

链状亚历山大藻是一种能产生麻痹性贝毒的有害赤潮藻类,研究环境因子对链状亚历山大藻生长特性的综合影响,找到链状亚历山大藻生长的适宜条件,对有效预报赤潮形成具有十分重要的意义.本文设计了四因素三水平的正交实验,研究了温度、盐度、营养盐、光照强度等环境因子对链状亚历山大藻生长特性的影响.结果表明,在实验范围内,链状亚历山大藻...     

东山岛星座短腹海鞘共附生微生物多样性研究

在前期研究发现星座短腹海鞘(Aplidium constellatum)脂溶性提取物具有降血脂功效的基础上,为深入了解该海鞘的生物学背景,开展了其共附生微生物的多样性研究,为进一步从该海鞘及相关共附生微生物中发现可能存在的降血脂活性次生代谢产物奠定基础。通过Illumina Mi Seq高通量测序技术,分析了星座短腹海鞘样品中共附生微生物的物种多样性和物种丰度信息。测序共获得37 911条序列,310个OTU;稀释曲线表明测序深度足够;多样性指数Simpson值为0.373,Shannon值为2.494。样品共附生细菌分属于24个门,优势门有变形菌门(Proteobacteria,78.86%)、放线菌门(Actinobacteria,6.01%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,4.67%)、蓝藻门(Cyanobacteria,2.62%)、厚壁菌门(Firmicutes,1.79%)、柔膜菌门(Tenericutes,1.76%)、螺旋菌门(Spirochaetae,1.33%);分属于197个属,优势属有Ruegeria(60.83%)、SAR116_clade科下未知属(3.27%)、Rhodococcus(2.40%)、Cyanobacteria纲下未知属(2.26%)、Candidatus_Hepatoplasma(1.76%)、Pe M15目下未知属(1.61%)、Spirochaetaceae科下未分类属(1.33%)等10个。通过纯培养技术共分离获得15株可培养共附生菌,分属于8个属,分别为弧菌属Vibrio(7株)、希瓦氏菌属Shewanella(2株),以及Pseudomonas、Pseudovibrio、Thalassobius、Exiguobacterium、Flavobacterium、Thalassospira属各一株。本研究首次为星座短腹海鞘提供了准确的共附生微生物背景数据,为进一步开展活性次生代谢产物研究提供了丰富的微生物菌株材料;同时研究还提示该海鞘有水产病原菌感染,在开发利用过程中应格外关注水产病原菌的安全风险防控。     

塔玛亚历山大藻产麻痹性贝类毒素能力的研究

为探究塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)产麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)的能力,通过设置不同空间效应、盐度和营养素浓度对塔玛亚历山大藻进行培养,分析不同培养条件下塔玛亚历山大藻产麻痹性贝类毒素的能力.结果表明:1)塔玛亚历山大藻中至少含有1...     

麻痹性贝毒和腹泻性贝毒的性质及检测技术研究探讨

鱼、贝等海洋生物通过对赤潮毒素的富集作用产生贝毒,人误食了这些含有赤潮藻毒素的鱼类和贝类后则有可能中毒甚至死亡,麻痹性毒素(PSP)和腹泻性毒素(DSP)是其中重要的两种赤潮毒素,他们毒性大、作用强,严重威胁着人类以及海洋生物的生命安全。本文详细阐述了这两种贝毒的化学性质、致毒机理以及毒性,并对当前常用的几种检测技术进行了对比说明。     

亚历山大藻(Alexandrium)分类研究现状

亚历山大藻(Alexandrium)是重要的赤潮种类之一,其属下的20余种甲藻约一半是有毒种类,它们不仅破坏渔业资源,破坏生态环境,而且它们能够产生PSP贝毒,危害人类健康。据报道,世界范围内每年由亚历山大藻产生PSP中毒死亡的人数多达几万人。亚历山大藻藻体外部结构简单,缺少有效和有用的鉴别特征,给这类甲藻的准确鉴定、分类工作带来许多困难,再加上分类标准和方法的不断更新、种类的合并拆分,致使许多研究工作者在赤潮监测计划中和赤潮发生期间不能对其进行快速、准确的鉴定,影响了各海岸国之间、科研人员之间的信息和情报交流。     

海带孢子体、配子体时期附生菌群落结构的比较

为探究海带(Saccharina japonica)生活史孢子体、配子体不同阶段的附生菌群落结构的差异,采用Illumina测序技术,分析了种海带(S1)、配子体(S2)、幼孢子体(S3)和大孢子体(S4)这4个不同阶段的藻体上附生菌16S rRNA序列,研究其附生菌群落结构。结果显示,4个阶段共识别出23门156属共244个操作分类单元(OTU)。从门分类上来说,变形菌门(Proteobacteria)在海带各阶段中均表现出较高的丰度,在S1、S2、S3和S4藻体样本中相对丰度分别达53.0%、94.3%、77.2%和36.7%,蓝细菌门(Cyanobacteria)只在S4藻体样本中表现出较高的丰度,为43.8%;从属分类上来说,假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)在各样本间差异较大,S2、S3和S4样本中相对丰度分别为65.00%、44.88%和25.57%,但在S1样本中仅为0.18%。各样品间附生菌群落结构差异较大,S1与S4样本相邻聚为一支,S2与S3样本为另一支。S2样本的菌群种类单一且分布不均匀,S1、S3与S4样本细菌种类丰富,但S4样本中菌群间的丰度差异较大。海带的苗种繁育阶段(S2和S3)存在褐藻酸降解菌丰度增加的趋势,孢子体阶段(S4)则具有高丰度的共生型蓝细菌。     

PCR-DGGE指纹图谱技术分析发病龙须菜附生菌菌群组成

本研究以07-2品系龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)为实验材料,提取自然条件下代表不同病变程度的健康、病间、白化藻体的附生菌DNA,经PCR扩增16S r DNA基因的V3可变区并进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),分离V3片段,再对目的条带进行克隆鉴定。实验结果经数据化后计算龙须菜附生菌数目并比较附生菌菌群多样性,通过非度量多维尺度分析(n MDS)及多元梯度分析(RDA)来比较附生菌菌群组成相似性及优势菌群。实验结果表明,随着龙须菜病变程度的加深,附生菌菌落数及菌群多样性逐渐增加(P0.05)。n MDS分析结果表明,健康藻体与白化藻体在附生菌菌群组成上存在差异,病间藻体在附生菌菌群组成上与健康藻体更为接近。RDA分析结果表明,龙须菜健康藻体附生菌可能的优势菌群是海洋单胞菌属(Marinomonas),病间藻体附生菌可能的优势菌群是单胞菌属(Alteromonas)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas),白化藻体附生菌可能的优势菌未能鉴定到,而白化残留藻体附生菌鉴定到的优势菌有Maribacter、红杆菌科、玫瑰变色菌属(Roseovarius)。从上述结果可以看出,龙须菜健康藻体与发病藻体在附生菌菌群组成及优势菌上存在较大差异,而介于两者之间的藻体在菌群组成上更偏向于健康藻体。     

链状亚历山大藻的培养及麻痹性贝类毒素的提取和检测

为了研究麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning toxins,PSP)的来源和检测,对实验室分离培养的产麻痹性贝类毒素的链状亚历山大藻进行了研究。首先通过接种对数生长期藻细胞,培养8 d内就能达到最高细胞密度(2.4×10⁴ cells/mL)左右,再以0.05 mol/L的醋酸超声波破碎藻细胞提取粗毒素,结合小白鼠生物检测法,经高效液相色谱分析,本株藻主要含有C1/2、GTX4、GTX5和NEO,浓度分别为GTX5(0.827 5)>GTX4(0.339 2)>C2(0.252 6)>NEO(0.126 6)>C1(0.045 5)(单位:μmol/L),毒素粗提液经过Sephadex-G15凝胶层析柱处理,用小白鼠生物法和荧光分光光度法联合检测定位,收集到纯度较高的PSP,本论文工作为将来贝类毒素的研究提供资料。     

不同温度对微小亚历山大藻生长和藻毒力的影响

<正>水体中的藻类是麻痹性贝毒的主要来源,现已知海洋中有13种单细胞的甲藻类可产生麻痹性贝毒。目前在我国海区已经发现的产毒甲藻主要有3种:塔玛亚历山大藻(Akexandrium tamarense)、微小亚历山大藻(Alezandrium minudum)、链状亚历山大藻(Alexandrium acatenella)。微小亚历山大藻在我国台湾沿海较常见。因此,有必要针对我国沿海的微小     

中国沿海贝类腹泻性贝毒的特征分析

<正>腹泻性贝毒是由有毒赤潮藻类鳍藻属(Dinophysis)和原甲藻属(Prorocentrum)中部分藻种所产生的热稳定的脂溶性多环醚类生物活性物质,主要成分为软海绵酸及其衍生物[1]。该毒素可在贝类等滤食性动物体内富集,通过食物链传递至人类,引起腹泻性中毒,危害食用者健康。腹泻性贝毒在全球沿岸海域均有分布,是世界范围内最具威胁的赤潮藻毒素之一。     

海州湾海域的赤潮生物

利用2003—2008年海州湾海域浮游植物的调查资料,对海州湾海域常见的赤潮生物进行描述、归纳及总结,为赤潮的常规监测和应急监测提供背景资料。结果表明,在海州湾海域共监测到121种赤潮生物,其中重要的赤潮生物有:中肋骨条藻、夜光藻、多纹膝沟藻、短角弯角藻、赤潮异弯藻、链状裸甲藻、海链藻属,这7种(属)赤潮生物都曾经在该海域引发过赤潮。此外,中华盒形藻、海洋原甲藻、梭角藻、三角角藻、圆筛藻属、角毛藻属等赤潮生物在海州湾海域常年分布,也具有引发赤潮的可能。     

链状亚历山大藻抑制消减杂交文库的构建及分析

为了筛选链状亚历山大藻特异表达的发光相关基因,应用抑制消减杂交技术,构建了链状亚历山大藻特异表达的cDNA消减文库,共获得500个克隆,通过基因PCR初步筛选表明插入片段的大小主要集中在250～1000 bp,随机挑选10个阳性克隆进行双向测序和序列比对分析,有2个克隆基因片段与已知基因序列高度同源,分别为荧光素结合蛋白和羧化酶/加氧酶,另有8个克隆基因片段在GenBank中未查找到相应的同源基因,可能为未知新基因序列.这些基因的获得为进一步研究链状亚历山大藻特异表达基因,阐明其发光机理及建立特异甲藻的新型检测方法提供重要依据.     

深圳大鹏澳海域翡翠贻贝中麻痹性贝类毒素的含量特征及生物相关因子分析

为了调查深圳大鹏澳海域翡翠贻贝(Perna viridis)中麻痹性贝类毒素(PSP)的污染特征,探析翡翠贻贝中PSP含量与水体中产毒藻种类的关联情况,2017年8月到2018年4月,每月在大鹏澳海域采集翡翠贻贝和浮游植物样品。贝类样品经石墨化碳黑固相萃取小柱净化后,采用超高效液相色谱串联质谱法测定13种PSP,初步调查了PSP的污染水平及产PSP藻类的种类与丰度。结果显示:浮游植物样品中均未检出PSP,而翡翠贻贝样品在2017年12月至2018年3月,共检出GTX2、GTX3、GTX5、dc GTX2、dc GTX3、NEO、C1和C2等8种毒素,每种毒素的质量浓度为2. 12～354. 55μg/kg,各个样品PSP的含量为0. 93～220. 90μg/kg(以STX计)。水体中优势藻均为中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis Cleve)和柔弱菱形藻(Nitzschia delicatissima)等硅藻,占浮游植物样品总量的90%以上,其他藻类种类少,丰度低。甲藻检出较多的有具尾鳍藻(Dinophysis caudata)、夜光藻(Noctiluca scintillans)、大角角藻(Ceratium macroceros)和叉角藻(Ceratium furca)等。2017年12月翡翠贻贝体内检出的PSP含量最高,之后迅速降至较低水平,而浮游植物中产PSP甲藻的比例未发现明显增加。大鹏澳翡翠贻贝中检出的PSP种类多,但大多为毒性较低的毒素种类。尽管深圳大鹏澳翡翠贻贝中PSP的含量低于欧盟的限量标准,但冬季仍有必要加强监测翡翠贻贝中PSP的污染状况。     

初始密度对微小亚历山大藻生长及产麻痹性贝类毒素的影响

为研究微小亚历山大藻生长和产麻痹性贝类毒素(PSP)的规律,采用不同初始密度对微小亚历山大藻进行培养,综合采用显微镜计数、小鼠生物检测(MBA)、高效液相色谱—柱后衍生(HPLC-FLD)等方法分析微小亚历山大藻在不同接种密度条件下的生长和产毒特性.结果表明,随着初始密度增加微小亚历山大藻通过静止期的时间缩短,到达最大生长密度的时间提前,但是生长的最大细胞密度和平均比生长率却呈下降趋势,增值模型反应的情况与观测结果相一致,随着初始密度的增加,依赖于初始种群密度的参数(a)减少,环境容量(K)减少,种群瞬时增殖速度(r)下降.4种不同初始密度(0.05×104、0.10×104、0.15×104、0.30×104cells/mL)条件下,微小亚历山大藻细胞的毒性呈现先增大后减小趋势,在初始密度为0.1×104 cells/mL条件下,同一生长期内细胞毒性比其他3个密度条件下高.HPLC检测微小亚历山大藻含有的毒素为GTX1-4,含量分别为2.14、2.08、4.97、5.04 fmol/cell.综合考虑微小亚历山大藻在生长过程中的细胞最大密度、达到最大密度所用时间以及细胞毒性大小等因数,采用(0.10～0.15)×104 cells/mL接种密度培养微小亚历山大藻,能够达到较好的产毒效果.     

环境因子对微小亚历山大藻Amtk-9生长与产毒的综合影响

微小亚历山大藻是产生麻痹性贝毒的主要生物之一。产毒藻株在不同培养条件下所产生的毒素总量有差异,因此研究环境因子对微小亚历山大藻生长与产毒的综合影响,找到微小亚历山大藻生长和产毒的适宜条件,对麻痹性贝毒在赤潮中是否造成贝类蓄毒有十分重要意义。本文设计了一个四因素三水平的正交实验,研究温度、盐度、营养盐、光照强度等环境因子对微小亚历山大藻Amtk-9生长与产毒的综合影响。结果表明:在实验范围内,微小亚历山大藻Amtk-9生长最佳条件为温度25℃,盐度30,培养基中氮含量为基础f/2培养液配方中氮磷含量的2倍,光照强度10000 lx。最佳产毒条件除了氮磷含量为基础f/2培养液配方中氮磷含量的3倍外,其它条件与生长的最佳条件相同。盐度、营养盐、光照这三个因素的不同水平对微小亚历山大藻Amtk-9指数生长期细胞比增长率、指数生长末期单位细胞含毒量均有极显著影响(F>F0.01)。温度对微小亚历山大藻Amtk-9的生长和产毒则无显著影响(F相似文献   

天津市售主要经济贝类中麻痹性贝类毒素污染现状及特征分析

使用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)检测9种天津市售主要经济贝类中13种麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)的含量,分析PSP的污染现状和成分特征。结果显示,共计6个品种(紫贻贝、虾夷扇贝、牡蛎、毛蚶、脉红螺、菲律宾蛤仔)检出PSP。其中虾夷扇贝、紫贻贝、毛蚶3个品种的检出率较高且含量较高,检出率分别为66.7%、58.3%、58.3%。PSP中检出率较高的毒素包括N-磺酰胺甲酰基类毒素C1、C2和膝沟藻毒素GTX1、GTX2、GTX3,毒力占比主要以膝沟藻毒素GTX1-4为主,毛蚶蓄积STX毒素的能力强于其他贝类。全年的PSP含量季节变化为夏季最高,冬季最低。PSP主要存在于贝类的消化腺内,全年不同月份的PSP含量均在安全食用范围内。     

渤海海域唐山贝类养殖区腹泻性和麻痹性贝类毒素的监测与风险评估

为监测渤海海域唐山贝类养殖区贝类毒素的污染情况,防止食用贝类中毒事件发生,于2019年10月—2020年9月间,每月持续在渤海海域唐山贝类养殖区采集四角蛤(Mactra veneriformis)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)、脉红螺(Rapana venosa)、牡蛎(Crassostrea gigas)、青蛤(Cyclina sinensis)、文蛤(Meretrix meretrix)和硬壳蛤(Mercenaria mercenaria) 7种经济贝类样品,采用高效液相色谱–串联质谱(HPLC-MS/MS)法测试了5种腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning, DSP)和14种麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning, PSP)。结果显示,在7种经济贝类样品中均未检出DSP。检出的PSP成分包括石房蛤毒素(Saxitoxin, STX)、膝沟藻毒素1 (Gonyautoxin 1, GTX 1)、膝沟藻毒素2 (Gonyautoxin 2, GTX 2)和脱氨甲酰基膝沟藻毒素3 (Ddecarbamoy l gonyautoxin 3, dcGTX 3),其中,GTX 1含量最高且最高值为537.95 μg/kg。不同季节贝类毒素蓄积含量有一定差异,PSP主要集中在4月检出。菲律宾蛤仔、牡蛎、文蛤和硬壳蛤中PSP的检出率分别为11.76%、47.06%、5.90%和8.82%,其他贝类均未检出。PSP总量均低于欧盟及中国的食用安全限量标准800 μg STXeq/kg。应用风险熵值法和点评估法进行食用安全风险评估,显示风险熵值和暴露风险指数均在安全范围内,结果表明,渤海海域唐山贝类养殖区7种经济贝类不存在食用安全风险。