猪源ETEC F18黏附素三种提取方法比较的研究

为探索更为有效的黏附素提取技术,本试验以猪源ETEC F18ab菌株为材料,通过三种方法(切割法、热洗脱法及联合热洗脱与切割法)各提取200 mL菌悬液中的黏附素,应用紫外可见分光光度计测定浓度并进行SDS-PAGE分析.结果显示,应用切割法、热洗脱法和联合热洗脱与切割法所得黏附素量分别为5.94、8.84和22.47 mg,即应用联合热洗脱与切割法提取的黏附素量明显高于单纯应用热洗脱法和切割法;SDS-PAGE分析表明,联合热洗脱与切割法提取的黏附素蛋白纯度稍低于单纯应用热洗脱法和切割法.综合分析上述结果可知,联合热洗脱与切割法更适用于大量黏附素抗原的提取.     

致病性F18大肠杆菌黏附素受体易感性仔猪的体外鉴定

在PCR-RFLP方法分析了不同猪个体FUT1基因M307位点等位基因多态性的基础上，制备M307位点为GG和AG2种类型仔猪小肠上皮细胞分别与表达F18ab菌毛的野生型大肠杆菌、表达F18ac菌毛含fed操纵子全基因的重组大肠杆菌及表面分泌表达F18ab菌毛FedF亚单位的重组大肠杆菌进行体外黏附和黏附抑制试验。结果表明，上述野生菌或重组菌对GG和AG2种基因型的30～35日龄断奶仔猪小肠上皮细胞均具有较好的黏附能力。上述3种大肠杆菌分别与抗F18ab纯菌毛血清、F18ac纯菌毛血清及抗F18ab菌毛FedF亚单位单因子血清作用后．则丢失黏附小肠上皮细胞能力。而GG基因型的3日龄仔猪小肠上皮细胞不能很好的黏附上述野生菌或重组菌．但是可以很好地黏附表达987P菌毛的大肠杆菌。     

F107(F18ab)菌毛的提取、提纯及鉴定

将致仔猪水肿病菌株107/86在TSB、TSA培养基上传代,使之表达F107菌毛,大量收集菌毛化的细菌,利用热洗脱法提取菌毛.粗提菌毛经1 5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳可见一条约15ku的条带,以染色的凝胶为对照,将未染色凝胶上的菌毛条带切下,捣碎,加生理盐水,37℃,2h后离心,吸出上清再次电泳,可见提纯的菌毛条带.用针对F107菌毛的单抗做免疫印迹反应,证实此条带为F107菌毛蛋白.     

F18大肠杆菌黏附素在染色体-质粒平衡致死系统中的表达

将含有启动子及核糖体结合位点RBS的E.coliK12菌株源asd基因克隆入表达质粒载体pnirBMisL-fedF中,构建重组表达质粒pMisL-fedF-asd,使该质粒中氨苄抗性基因失活的同时能表达fedF和asd基因。该重组质粒pMisL-fedF-asd转化E.coliDH5α宿主菌asd基因缺失株即DH5α△asd菌株后,表达F18E.coli黏附素的DH5α△asd重组菌能在不含DAP的LB平板生长,构成非抗性平衡致死系统。厌氧条件下诱导培养后,经玻板凝集反应、间接免疫荧光试验及易感仔猪小肠上皮细胞黏附试验表明,F18E.coli黏附素在DH5α△asd菌体表面得到了功能性展呈。经20次传代培养没有发现质粒丢失,F18E.coli黏附素在该系统中持续稳定表达。该染色体-质粒平衡致死系统的成功构建为研究F18E.coli黏附素亚单位疫苗在动物体内的免疫效果提供了一个安全有效的操作平台。     

猪胸膜肺炎放线杆菌自动转运黏附素基因的克隆与表达

为了研究猪胸膜肺炎放线杆菌保护性免疫机制,试验筛选猪胸膜肺炎放线杆菌3~8 kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆,测序拯救质粒得到序列,通过Blast分析确定此片段为猪胸膜肺炎放线杆菌自动转运黏附素(AT-Adhensin)基因,根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该黏附素蛋白。结果表明,该蛋白与猪传染性胸膜肺炎康复期血清发生反应。     

猪水肿病大肠杆菌F18ab菌毛A亚单位与志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位的联合表达

扩增、克隆和表达了水肿病大肠杆菌的致病因子F18ab 菌毛的主要亚单位FedA全基因(包括信号肽序列),并与现有的另一致病因子志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因(stx 2eA)连接,然后进行联合表达。同时用已制备的抗Stx 2eA 单克隆抗体和抗F18ab菌毛单克隆抗体对联合表达的融合蛋白质进行检测鉴定。     

F107(F18ab)菌毛单抗的制备、鉴定与初步应用

将大肠杆菌107／86和水肿病菌株在TSB中培养，鉴定其表达F107菌毛，前者作为免疫原免疫BABL／C小鼠，后者作为检测抗原包装酶标板。细胞融合后经ELISA和玻板凝集检测，得到一株阳性杂交瘤细胞株，命名为F7－1。该细胞株制备的腹水ELISA效价为：2^16，试管凝集价为：1：5120，在免疫印迹中可与提取的F107菌毛特异性条带发生反应。利用此单抗检测表明，91％的水肿病菌株表达F107菌毛。     

大肠杆菌F18ac菌毛FedA蛋白的表达与鉴定

根据已经发表的F18ac菌毛A亚单位的基因序列(FedA)设计一对引物,利用PCR技术从重组质粒T 8813A 中扩增到一段序列,并按预定的阅读框插入表达性质粒载体pGEX 6p 1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pPFedA/ac,并转化大肠杆菌BL 21 获得重组菌PPFedA/ac。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该序列大小为456 bp,与已发表的FedA/ac结构编码序列完全一致。通过对菌体裂解物的SDS PAGE 分析以及Western blotting 鉴定,证明重组大肠杆菌PP FedA/ac的可以表达融合蛋白形式的FedA/ac (命名为GST FedA/ac),即FedA/ac蛋白(15.317 ku)与谷胱苷肽转移酶(27.335 ku)相连组成分子量为42.652 ku的融合蛋白。利用GST FedA/ac制备的兔抗GST FedA/ac 血清与大肠杆菌F107/86 株( F18ab )、2 134 P 株(F18ac )进行的玻板凝集试验呈现阳性反应,进一步表明了表达的正确性。     

禽类全血DNA不同提取方法的比较

以4个不同禽类品种(金定鸭、长乐灰鹅、象洞鸡和闽南火鸡)为试验材料,采用4种不同方法从其全血中提取DNA,比较不同方法的DNA提取效率。结果表明:由于品种之间DNA存在差异,DNA的质量和产率也有显著差异,金定鸭全血DNA用树脂法效果最佳;长乐灰鹅和闽南火鸡全血DNA用酚-氯仿法效果最佳;而盐析法是提取象洞鸡全血DNA的最佳方法。     

大肠杆菌F18菌毛A亚单位基因的多样性分析

根据已经发表的大肠杆菌F18ab菌毛A亚单位(FedA／ab)的基因序列(fedA／ab)设计1对引物，利用PCR技术从本实验室保存的10株大肠杆菌(F107／86、YCED1、YCED2、C、D、E、12F、2134P、8199、8813)中分别扩增到一段序列．并克隆至pGEM-T载体，获得重组质粒TF107A、TYCED1A、TYCED2A、TCA、TDA、TEA、T12FA、T8813A、T8199A、T2134PA。通过序列测定，并与已发表的fedA／ab进行比较、基因树分析，可将这10个菌株分为2个基因群，其中F107／86、YCED1、YCED2、C、D、12F与fedA／ab具有高度同源性，属于fedA／ab．大小为513bp；E、8813、8199、2134P构成另一单独的分支，属于fedA／ac．大小为516bp。     

猪TLR4基因在F18大肠杆菌抗性型和敏感型资源群体间的差异表达分析

本研究旨在检测TLR4基因mRNA在猪各个组织的分布以及在F18大肠杆菌抗性型和敏感型群体间差异表达水平,为探讨该基因在免疫识别和F18大肠杆菌抗性中发挥的作用提供理论依据。本试验运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术进行定量测定。首先,各取8头35日龄F18大肠杆菌抗性型和敏感型苏太仔猪组织样,包括心脏、肝脏、脾脏等11个组织,提取总RNA,以GAPDH基因为内参基因,进行实时荧光定量PCR。对TLR4基因mR-NA进行均一化处理,利用荧光阈值(Ct值)计算TLR4基因mRNA在各个组织以及F18大肠杆菌抗性型和敏感型群体间表达量。结果显示,TLR4 mRNA在猪各种组织中广泛表达,在肺、淋巴结、肾脏和脾脏等免疫器官中表达量较高,F18大肠杆菌敏感型的TLR4基因表达量普遍高于抗性型个体的表达量,在各个组织中(除胃外)TLR4表达量差异倍数从1.083到2.980不等;在肺、淋巴结、肾脏和胸腺组织中,F18大肠杆菌敏感型的TLR4基因表达量显著高于抗性型个体的表达量(P<0.05)。本研究结果表明,TLR4基因通过天然免疫识别机制对猪F18大肠杆菌病等革兰氏阴性疾病有一定的影响,TLR4基因表达量...     

大肠杆菌F18ac菌毛F亚单位基因的克隆与序列分析

根据已经发表的F18ab菌毛F亚单位(FedF／ab)的基因(fedF／ab),设计一对引物,利用PCR技术从表达F18ac菌毛的大肠杆菌2134P株、8199株、8813株中分别扩增到一段序列,并克隆至pGEM—T载体,获得重组质粒T8813F、T8199F、T2134PF。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明,该3个序列大小均为903bp,与fedF／ab大小一致且具有较高的同源性(99．4％),推导的FedF／ac氨基酸序列与FedF／ab同源性为98．3％。数据表明该实验所克隆的序列均为F18ac菌毛F亚单位(FedF／ac)的基因(fedF／ac)。     

Differential Expression Analysis of MUC4 and MUC13 Genes Between Resistant and Sensitive Weaned Meishan Piglets to ETEC F18

MUC4 and MUC13 genes as important candidate genes for enterotoxigenic Escherichia coil (ETEC) F4 resistance,may play an important role in the process of against ETEC F18 infection in weaned piglets. In this study,ETEC F18-resistant and -sensitive weaned Meishan piglets were used,and the expression levels of MUC4 and MUC13 genes in 11 tissues (heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,muscle,thymus,lymph nodes,duodenum and jejunum) were determined by quantitative Real-time PCR. The results showed that MUC4 and MUC13 genes were broadly expressed with different expression levels in all the 11 tissues. In the thymus and lymph tissues,the expression of MUC4 gene in resistant piglets was significantly higher than that in sensitive piglets (P<0.05);In the lung tissue,theMUC13 gene expression level in resistant individuals was significantly higher than that in sensitive individuals (P<0.05),and in the intestinal tissues of duodenum and jejunum, the expression level of MUC13 gene was relatively higher in resistant individuals. Thus we speculated that the high expression of MUC4 gene in immune tissues and MUC13 gene in intestinal tissues might improve the immune ability of piglets,protect and lubricate the intestinal tract, and resist ETEC F18 infection.     

致断奶仔猪腹泻、水肿病大肠杆菌F18菌毛a因子单克隆抗体的研制及其初步应用

以表达 F18ac菌毛参考菌株 2 134(O15 7∶ H19)为研究对象 ,摸索出了 F18ac菌毛表达的最佳条件 ,采用热洗脱法获得了较纯的 F18ac菌毛 ,并以之免疫小鼠 ,利用淋巴细胞杂交瘤技术 ,用直接玻板凝集法筛选出 1株杂交瘤细胞株 19B4 ,能稳定分泌针对 F18ac菌毛和 F18ab菌毛共同抗原表位 a因子的单克隆抗体。细胞培养上清对 F18ac菌毛参考菌株 2 134和 F18ab菌毛参考菌株 10 7/ 86的直接凝集价均可达 1∶ 8,腹水单抗直接凝集效价可达 1∶ 10 2 4 ,而与猪源产 F4、F5、F6和 F4 1粘附素大肠杆菌菌株、鸡源产 型菌毛大肠杆菌菌株及沙门氏菌不发生凝集反应。免疫印迹试验结果显示 ,腹水单抗可同时特异识别 F18ac菌毛 170 0 0和 F18ab菌毛 15 0 0 0左右的主要亚单位多肽。应用所研制的单抗对 2 15株断奶仔猪腹泻大肠杆菌分离株进行了检测 ,结果上述分离株 TSB培养物的 F18菌毛的检出率为13.4 % ,TSA培养物的检出率为 8.4 %。F18菌毛阳性分离株的 O血清型除了常见血清型 O139、O14 1外 ,还有非常见血清型 O10 7、O131和 O9等。TSB培养物的 F18菌毛检出率明显高于 TSA培养物的检出率 ,表明 F18菌毛在 TSB培养基中比在 TSA培养基上更容易表达 ,TSB培养基是适合 F18菌毛检测、流行病学调查的培养基