野桑蚕NPV与家蚕NPV的外形差异及多角体蛋白基因的研究

通过电子显微镜观察 ,发现从野桑蚕体内分离的核型多角体病毒 (BmmNPV)经空斑筛选 ,其分离株的多角体外形和家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)的多角体外形呈现差异。对PCR扩增出的BmmNPV的多角体蛋白基因polh进行克隆、测序 ,并与BmNPV的polh序列比较 ,结果发现BmmNPV的polh在 +2 2、+70 3和 +711的 3个位点的碱基不同 ,使 +7位、+2 99位的Pro变成了Ser,+711位G变成为A ,而没有引起该位点 +2 31位Ala的改变。由Ser和Pro在形成蛋白二级结构的构象常数可以推测 ,BmmNPV的多角体较BmNPV更稳定 ,查明了多角体在外形存在差异的原因是ORF内碱基的差异引起的。     

家蚕与中国野桑蚕的RAPD标记遗传多样性比较分析

对家蚕品种C10 8及江苏地区野桑蚕进行了RAPD分析 ,并利用已有的不同家蚕品种及其它地区野桑蚕的RAPD数据 ,比较了家蚕品种内和野桑蚕地理种群内个体间、家蚕品种间和野桑蚕地理种群间的遗传多样性。家蚕品种内的多态位点比率、Shannnon信息指数、Nei基因多样性指数等都远较野桑蚕地理种群内个体间的小 ,2 5个家蚕品种在分组和未分组时的遗传多样性指数仅有一组例外 ,其余均较野桑蚕地理种群间的大。由此说明家蚕品种内的遗传多样性比野桑蚕地理种群内个体间的低 ;而家蚕品种间的遗传多样性水平却比野桑蚕地理种群间的高。未分组家蚕品种间的遗传多样性指数略大于分组后的 ,表明分析比较的样本数不同对结果也有一定影响。     

中国野桑蚕和日本野桑蚕的RAPD研究

用RAPD PCR技术初步研究了中国野桑蚕与日本福冈野桑蚕之间的DNA多态性。结果表明 ,不同地域中国野桑蚕个体之间及其与日本福冈野桑蚕个体之间均呈现出丰富的DNA多态性。中国野桑蚕同家蚕共有带率达 3 5 5 % ,同日本福冈野桑蚕为 4 5 1% ,而日本福冈野桑蚕同家蚕为 3 2 % ;中国野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为0 5 2 ,日本野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为 0 6 3,与中国野桑蚕的为 0 5 8,而且与中国沈阳地区野桑蚕之间的遗传距离最近 ,为 0 4 8,以此创建了它们的系统进化树。     

中国野桑蚕抗病毒蛋白基因(Lipase)的克隆与活性鉴定

从中国野桑蚕幼虫中肠细胞克隆获得了抗家蚕核型多角体病毒BmNPV的脂肪酶基因(Lipase)cDNA(GenBank:AY945212)。该基因cDNA大小906 bp,编码301个氨基酸,蛋白质分子质量约为28.9 kD。进一步克隆了其全长基因组,结果表明该基因由2 147 bp组成,包含4个外显子和3个内含子。该基因在野桑蚕体内的表达具有组织特异性,仅限于野桑蚕中肠组织表达,且在幼虫龄中表达水平较高,而在幼虫眠期和熟蚕期几乎没有表达。通过基因体外表达获得的重组蛋白Lipase,能够有效抑制BmNPV病毒对家蚕的感染,说明该蛋白具有较强的抗BmNPV的生物学活性。     

野蚕体内分离的NPV和BmNPV对家蚕和野蚕的交叉感染性研究

在昆虫病毒中,杆状病毒(Baculovirus)是以众多的病毒粒子同时封存在一个折光性强、具有蛋白质性质、直径在0.5～10μm的多角体内为特征的。由于杆状病毒曾经直接威胁了养蚕业的发展,早在19世纪中叶就受到了人们的注意和研究。自1970年Goodwin用杆状病毒感染了昆虫细胞系,建立了第1个杆状病毒-昆虫细胞离体系统之后,人们对昆虫杆状病毒的研究不断深入。近年来,昆虫病毒的分子生物学研究进展较快,3种杆状病毒(AcMNPV、OpMNPV、BmNPV)全基因组序列已公布,为从分子进化的角度研究昆虫病毒进化的关系提供了可能。     

利用BmNPV多角体包埋外源蛋白的观察

家蚕核型多角体病毒在感染晚期大量表达产生多角体蛋白,并形成结构致密的超大分子蛋白质晶体,以有效保护内部包埋的病毒粒子,保证子代病毒的传播。借鉴多角体包埋病毒粒子的原理,观察到多角体也能将外源蛋白质固定入多角体内部。利用能形成多角体的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建的含有绿色荧光蛋白(EGFP)的重组病毒能在表达、产生正常多角体的同时也表达EGFP蛋白。共聚焦分析表明,该重组病毒感染后形成的多角体能够发射绿色荧光。被包埋的EGFP蛋白放置1个月后仍能检测到绿色荧光,干燥处理30min后仍能检测到荧光。由此说明将多角体与外源基因同时表达,多角体中会包埋外源蛋白,且能较长时间保存外源蛋白的生物活性。这一现象为解决蛋白质长期保存提供了新思路,对于开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂也有很好的参考意义。     

柞蚕NPV多角体膜蛋白类似基因的克隆和序列分析

为探明柞蚕核型多角体病毒(Anthraea pernyi nucleopolyhedrovirus,ApNPV)基因组信息,从柞蚕尸体中分离纯化ApNPV,提取其基因组DNA,分别建立ApNPV DNA的HindⅢ和SalⅠ酶切片段文库。对插入片段进行测序,经过同源性分析发现,在2．9kb的SalⅠ片段上包含1个多角体膜蛋白类似基因,其读码框编码289个氨基酸,是一个晚期表达基因。氨基酸同源性比较的结果表明,ApNPV的多角体膜蛋白基因与云杉卷叶蛾(Choristioneure fumiferana)NPV的同源性较高,达91．7%,而与家蚕(Bombyx mori)NPV及苜蓿尺蠖(Autographa califorlica)MNPV的同源性较低,分别为65．1%和63．0%。该结果说明ApNPV与CfNPV在进化关系上较近,而与BmNPV和AcNPV在进化关系上较远。比较多种核型多角体病毒的多角体膜蛋白和多角体蛋白的氨基酸序列发现,这两种多角体结构蛋白的同源性具有相似的变化趋势。     

广西地区家蚕品种资源对BmNPV抵抗性的初步调查

以广西地区现有的84个家蚕品种品系为材料,于2龄起蚕经口接种BmNPV,调查不同品种品系对BmN-PV经口感染的抵抗性。结果表明:不同蚕品种间对BmNPV经口感染的抵抗性存在显著差异,供试品种中7532(B)的发病率最低,为21.46%;Z6、中黄4、9497等品种的发病率高达100%;发病率55%以下的品种中绝大多数为日系品种;同一品种不同品系间的抵抗性也有一定的差异。研究结果可为进一步选育抗性品种提供依据。     

不同地区BmNPV药物耐受性的测定

用生产上常用的消毒净作为消毒药物，对4个不同地区的BmNPV进行不同时间的消毒后，添食三龄起蚕，累计病蚕头数，计算相对发病率，比较4个地区的BmNPV对消毒净耐受性的大小。实验结果表明：不同地区的BmNPV对消毒净的耐受性是有差异的，遂溪BmNPV对消毒净的耐受性最强，其次是埃及BmNPV，最弱的翁源BmNPV和徐闻BmNPV。     

BmNPV病毒的P10基因研究进展

家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV）是一种杆状病毒，而P10基因是杆状病毒的一种晚期高交表达基因。为了进一步了解P10基因在家蚕作为外源表达载体中的作用，现对国内外在BmNPV的P10基因方面的研究进行综述，以提高对P10基因的应用。     

家蚕来源肠球菌DNA多态性的RAPD分析

运用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术,对从家蚕消化道中分离的表现为生理生化特性多样性的14个肠球菌分离菌株和3个标准菌株进行了DNA多态性研究。应用筛选的8条随机引物,共扩增出625个位点,其中997%为多态性位点,表明供试菌株具有丰富的DNA多态性。对扩增结果进行聚类分析,供试菌株分为Entfaecalis、Entfaecium、Entcasseliflavus、Entavium等4个类群,与其数值鉴定结果呈相同趋势。     

不同饲料饲养对家蚕抗核型多角体病毒病的能力以及体内3种代谢酶活性的影响

为探讨饲料与家蚕核型多角体病发生的关系及家蚕核型多角体病发生与蚕体内代谢酶活性的关系,研究比较了用桑叶、柘叶饲养的家蚕对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的抵抗性以及与抗性相关的羧酸酯酶、碱性磷酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性变化。结果表明:BmNPV对柘叶饲养家蚕的感染中量(ID50)和致死中量(LD50)分别为1.319×105PID/头和1.632×105PID/头,与对桑叶饲养家蚕的ID50和LD50相比,仅为1/2和1/4左右,即柘叶饲养家蚕对BmNPV的抵抗力明显降低;不论用柘叶饲养还是用桑叶饲养的家蚕感染BmNPV后,蚕体内的羧酸酯酶活性均大幅度上升,碱性磷酸酯酶与乙酰胆碱酯酶活性均显著下降,且柘叶饲养家蚕感染BmNPV后体内的碱性磷酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性比桑叶饲养家蚕感染BmNPV后的酶活性更低。     

化学诱变的BmNPV对家蚕细胞和虫体感染性的初步研究

前文报道化学诱变剂对家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)多角体形态有明显的诱变作用 ,诱变的BmNPV基因组对某些限制性内切酶的酶切电泳谱发生变化。本文研究进一步表明 :诱变BmNPV感染家蚕Bm N细胞的病变特征与对照相比没有明显不同 ,但形成不定形超大多角体的空斑时间延迟2～ 3d;诱变BmNPV感染家蚕幼虫后 ,病蚕体内各组织病变损害的感染程度 (易感性 )与对照基本相同。研究结果提示 ,诱变的BmNPV对家蚕培养细胞、虫体组织的感染性无显著变化     

家蚕杆状病毒半胱氨酸蛋白酶基因的序列分析及表达

通过PCR扩增技术克隆了家蚕核型多角体病毒 (BombyxmoriNuclearPolyhedrosisVirus ,BmNPV)ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cysteineproteinase ,CP)基因 (BmNPVZJ8 CP)。序列分析表明 ,该蛋白酶基因的ORF为 972个核苷酸 ,编码 32 3个氨基酸。同源性分析表明 ,BmNPVZJ8 CP在DNA水平上与其它来源的CP具有较高的同源性 ,根据已知的杆状病毒半胱氨酸蛋白酶序列构建了该基因的进化树 ,发现BmNPVZJ8 CP与人的木瓜蛋白酶超家族的CP在同一进化分支上 ,与BmNPV T3株、AcNPV的半胱氨酸蛋白酶基因的核苷酸同源性最高。该基因在大肠杆菌中表达的产物对大肠杆菌具有生理毒性 ,从而限制了该基因的表达。     

野桑蚕羧酸酯酶基因(BmmCarE-2)的克隆及表达分析

羧酸酯酶参与昆虫对有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂抗性的产生。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了一个野桑蚕羧酸酯酶全长基因(BmmCarE-2)。序列分析表明该基因包含1个1 623 bp的开放读码框,有57 bp的cDNA5′端非翻译区序列(5′UTR)和79 bp的cDNA3′端非翻译区序列(3′UTR),编码540个氨基酸,GenBank登录号为EU328351。序列比对分析表明BmmCarE-2与家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-2(GenBank登录号:DQ311250)的氨基酸序列相似性最高,达98.9%。利用半定量RT-PCR进行组织表达分析表明,BmmCarE-2在野桑蚕幼虫的头部和脂肪体表达量较高,在丝腺和中肠稍低,而在血液中的表达量最低。     

野桑蚕12S rRNA基因的克隆及序列分析

通过PCR技术,对中国山东青州野桑蚕mtDNA的12SrRNA基因进行了克隆和序列分析。结果表明,青州野桑蚕12SrRNA基因为788nt,在DNA水平上,与家蚕12SrRNA基因的同源性达到99%,与中国陕西安康、日本筑波来源的野桑蚕12SrRNA基因的同源性分别为97%、98%;分子进化分析显示,家蚕可能是起源于中国野桑蚕。     

野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmmace1)5′端非翻译区序列的剪切方式分析

通过5′cDNA末端快速扩增(RACE)的方法,克隆了野桑蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmmace1)的cDNA 5′端非翻译区序列(5′UTR)区域,与家蚕乙酰胆碱酯酶1型基因(Bmace1)的cDNA 5′UTR(242个碱基)进行比较分析表明,Bmmace1的5′UTR包含有231个碱基,存在2个位点的点突变和一段连续11个碱基的缺失。通过克隆和测序分析野桑蚕基因组中Bmmace1的5′UTR片段,表明Bmmace1和Bmace1基因的RNA剪切都遵循GT-AG规则,但在其cDNA 5′UTR的RNA剪接过程中可能存在差异,Bmmace1在其cDNA上游+33处存在比Bmace1少剪接的序列TGATTTGAAGG,而在其基因组中5′UTR的TGATTTGAAGG序列下游-4位点缺失ACAGA序列。研究结果可为深入探讨Bmmace1基因与野桑蚕产生抗药性的关系提供基础信息。     

野桑蚕多酚氧化酶的部分生化特性分析

基于开发专一的酶抑制剂控制野桑蚕危害桑园的目的,采用硫酸铵分级沉淀及Sephadex G-100凝胶过滤等方法,纯化了野桑蚕(Bom byx mandarina)多酚氧化酶,纯化倍数为57.14倍。该酶对焦性没食子酸、邻苯二酚和L-多巴的米氏常数(Km)值分别为3.39、2.06和3.17 mmol/L,在pH 7.0、37℃时活性最高。利用硫脲、抗坏血酸等多种氧化酶抑制剂对该酶活性的抑制结果表明,所用抑制剂对其均有不同程度的抑制作用。此外,该酶对乙二胺四乙酸(EDTA)和金属离子比较敏感。