提高甘草原生质体游离产量及分裂频率的研究

为探讨影响胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Batal.)原生质体游离的因素,提高原生质体游离产量和分裂频率,试验采用纤维素酶、果胶酶、离析酶不同浓度组合的酶解液,在3种酶解方式下对甘草叶片、下胚轴、愈伤组织进行了原生质体游离。结果表明:苗龄11 d的甘草叶片、下胚轴及继代5次的愈伤组织是原生质体游离的良好材料,三者均在2.0%纤维素酶+0.5%果胶酶和2.0%纤维素酶+0.25%离析酶+0.5%果胶酶的酶解液中原生质体游离频率最高,其产量和活力分别为1.25×10⁵~1.26×10⁵个·g^-1,65.7%~70.5%;1.43×10⁵~1.44×10⁵个·g^-1,69.5%~72.8%;1.10×10⁵~1.16×10⁵个·g^-1,61.9%~69.4%;纵向切割的下胚轴平均原生质体产量和活力高于叶片和愈伤组织,分别为1.19×10⁵个·g^-1,65.2%。此外,在40 r·min^-1摇床上处理7 h的酶解混合物中原生质体产量最高;而先静置后缓慢震荡(40 r·min^-1)的酶解方式可得到最佳原生质体产量和活力。将原生质体密度调整到1×10⁵个·g^-1并培养于KM8P培养基中,能获得最高频率的原生质体分裂频率(2.34%)。试验获得了较好的甘草原生质体游离及分裂体系。     

扁蓿豆愈伤组织原生质体分离条件的研究

以扁蓿豆(Melilotoides ruthenica(L.)Sojak)下胚轴愈伤组织为材料,研究酶液组合、酶解时间、酶液渗透压、继代培养时间及预处理措施对其原生质体分离效果的影响,以期确定能够酶解出高数量且高活力的原生质体的酶解条件。结果表明:获得有活力原生质体的最佳酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶、酶解时间为12 h、酶液渗透压即甘露醇浓度为0.55 mol·L^-1,愈伤培养天数为10~12 d、预处理措施为黑暗24 h。     

乳酸菌和纤维素酶对光叶紫花苕青贮发酵品质的影响

为明确乳酸菌、纤维素酶及二者混合物对光叶紫花苕（Vicia villosa var. glabrescens）青贮发酵品质的影响,设置CK、乳酸菌（0.5×10⁶, 1.0×10⁶,1.5×10⁶ cfu·g^-1）、纤维素酶（2.0, 3.3, 4.6 g·t^-1）,以及乳酸菌+纤维素酶（0.5×10⁶ cfu·g^-1+2.0 g·t^-1,1.0×10⁶ cfu·g^-1 + 3.3 g·t^-1, 1.5×10⁶ cfu·g^-1+4.6 g·t^-1）共10个处理,青贮60 d后测定相关指标。结果表明：除乳酸菌外,其他处理组都不同程度的降低了青贮饲料pH值,增加了可溶性碳水化合物（WSC）含量;添加3.3 g·t^-1纤维素酶显著降低了青贮饲料的中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量（P<0.05）;添加1.0×10⁶ cfu·g^-1乳酸菌+3.3 g·t^-1纤维素酶显著提高了青贮饲料的粗蛋白（CP）和乳酸含量（P<0.05）;添加0.5×10⁶ cfu·g^-1乳酸菌+2.0 g·t^-1纤维素酶显著降低了氨态氮（NH₃-N）含量（P<0.05）。综合各项指标,添加0.5×10⁶ cfu·g^-1乳酸菌、2.0 g·t^-1纤维素酶或1.0×10⁶ cfu·g^-1乳酸菌+3.3 g·t^-1纤维素酶的光叶紫花苕发酵品质最好。     

草地早熟禾午夜Ⅱ号原生质体培养及植株再生

对草地早熟禾(Poa Pratensis L.)品种-午夜Ⅱ号进行了原生质体培养及其植株再生的研究。以午夜Ⅱ号成熟种子诱导的松软胚性愈伤组织为材料,利用酶解法分离出大量有活力的原生质体。原生质体经培养,持续分裂形成愈伤组织,并分化出再生绿苗和白化苗。研究了不同酶液组成和酶解时间对原生质体游离的影响。结果表明:采用继代培养8-10 d的胚性愈伤组织在1.0%纤维素酶+1.0%离析酶+0.5%果胶酶+0.3%崩溃酶条件下,酶解14-16 h可得到产量和活力较高的原生质体。原生质体以2.0×10⁵-5.0×10⁵个/mL的植板密度,采用液体浅层法在附加1.0 mg/L 2,4-D、0.3 mg/L 6-BA、100 mg/L水解酪蛋白、100 mg/L水解乳蛋白、1.0%蔗糖、0.4 mol/L甘露醇的KM₈P培养基中培养,可形成较小的愈伤组织。愈伤组织经过增殖在分化培养基上(MS+0.5mg/LNAA+2.0 mg/L 6-BA)可诱导芽、根的形成,再生出完整植株。     

桑树原生质体分离条件的优化试验

为了分离获取高产量、高活力的桑树原生质体,分别以桑树的组培苗细切叶片、胚性悬浮培养细胞、粗切愈伤组织和细切愈伤组织等为材料,采用正交试验和单因素试验的方法对桑树原生质体酶解分离条件中的分离酶液组合、渗透压调节剂、酶解温度、酶解时间等因素进行优化。最佳分离酶液组合为100 U/mL纤维素酶R-10+150 U/mL果胶酶Y-23+6 U/mL离析酶R-10+细胞-原生质体洗液(1 480 mg/L CaCl2.2H2O,27.2 mg/L KH2PO4),以0.6 mol/L甘露醇为渗透压调节剂,在28℃酶解温度条件下酶解6 h,用桑树胚性悬浮培养细胞作分离材料可获得7.8×106个/g的原生质体产量,且原生质体活力达91.4%。研究结果显示,选择合适的分离材料以及酶解分离条件是高效获取高活力桑树原生质体的关键。     

甘农4号紫花苜蓿愈伤组织原生质体游离条件的研究

以甘农4号紫花苜蓿下胚轴诱导所得愈伤组织为材料,研究酶液组合,渗透压调节物甘露醇浓度,酶解时间,愈伤组织继代时间及预处理措施对原生质体游离效果的影响。结果表明:当酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%半纤维素酶,渗透压为0.6mol/L甘露醇,愈伤组织继代培养时间为12d,预处理措施为在CPW-11溶液中预质壁分离1h,酶解时间10～12h时,游离出的原生质体产量最高,可达3.34×106个/g,原生质体活力高达82.8%。     

华南象草原生质体分离及基因瞬时表达研究

以华南象草(Pennisetum purpureum)幼叶鞘为材料,采用L₁₆(4⁵)正交试验设计,对分离原生质体过程中的纤维素酶浓度、离析酶浓度、酶解液pH、甘露醇浓度、酶解时间5个因素进行筛选,建立了高效的象草叶鞘原生质体分离体系,并进行目标基因的瞬时转化,以期为象草基因功能研究奠定基础。结果表明:叶鞘在含有1.5%纤维素酶R-10,0.75%离析酶R-10,0.5 mol·L^-1 甘露醇,pH为5.8的酶解液中酶解4 h,原生质体产量达5.11×10⁶个·g FW^-1,活力达91.08%,酶解时间对象草原生质体产量和活力的影响最大。用PEG介导法将2个分别带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的载体转入原生质体中,转化效率最高可达77.47%,共转化效率为8.79%。所分离的原生质体可用于基因的瞬时表达研究。     

柱花草叶肉原生质体提取与瞬时表达体系构建

柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明：采用1.5%纤维素酶、1.25%离析酶、0.5 mol·L^-1甘露醇和4 mmol·L^-1MES酶解液组合,酶解时间为16 h时,原生质体的产量和活性均达到最佳,分别为(4.567×10⁶)个·g^-1和92.271%;原生质体浓度为(6×10⁵)个·mL^-1、质粒浓度为0.6μg·μL^-1,PEG-4000浓度为50%、转化时间为5 min时,转化效率最高,可达52.524%。构建了目标蛋白SgRKL1表达载体pA7-BIUTNT::SgRKL1-GFP,利用PEG介导法将其转入柱花草原生质体,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示SgRKL1蛋白定位于细胞膜上,说明所建立的柱花草叶肉原生质体瞬时表...     

陇东野生紫花苜蓿愈伤组织原生质体游离条件的筛选

以陇东野生紫花苜蓿子叶诱导的愈伤组织为材料,研究了酶解时间、酶液组合、酶液中甘露醇浓度、预处理措施及愈伤组织继代培养时间对其原生质体游离效果的影响.结果表明:当酶解时间为10h、酶液组合为2%纤维素酶+0.5%果胶酶+0.3%离析酶+0.3%半纤维素酶+0.3%崩溃酶、甘露醇浓度为0.60mol/L、预处理措施为CPW-10溶液中浸泡1h、愈伤继代培养天数为12～14d时,游离出的原生质体产量最高,可达19.5×105个/g,存活率高达89.7%.     

匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体瞬时表达体系的建立

为了建立稳定、高效的匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera L.）叶肉细胞原生质体瞬时表达体系，本研究以匍匐翦股颖‘Penn-A4’的叶片为材料，分析不同因素对其叶肉细胞原生质体分离的影响，确定其原生质体分离的最佳条件。结果表明：苗龄为4周的翦股颖无菌苗叶片在甘露醇为0.6 mol·L^-1的酶解液中，28℃酶解4 h后，可分离得到较高活力原生质体、提取量约为6.75×10⁶个·g^-1；为进一步检测该原生质体是否可有效的应用在蛋白功能研究中，构建了热激蛋白基因AsHSP26.8-GFP重组质粒，并在聚乙二醇（PEG-4000）介导下将其导入叶肉细胞原生质体中进行了亚细胞定位；通过激光共聚焦显微镜观察到AsHSP26.8定位于叶绿体。综上所述，本研究建立了一套较为完整的匍匐翦股颖叶肉细胞原生质体分离与瞬时表达体系，为探究匍匐翦股颖的功能基因组学研究奠定了基础。     

根癌农杆菌介导的1─磷酸甘露醇脱氢酶基因转化百脉根的研究

本文以百脉根子叶外植体为受体材料，通过根癌农杆菌介导的方法，导入外源目的基因1－磷酸甘露醇脱氨酶（mtlD）基因和npt－Ⅱ基因，建立了转化系统，获得转基因植株，转化频率为9．7％．转化处理的外植体再生植株的茎段在含卡那霉素的分化培养基上膨大，再生成苗和植株。抗性植株的形态正常，移入盆栽后生长良好。PCR扩增与扩增产物的Southern杂交证明外源基因已整合到百脉根基因组上。     

低磷与干旱胁迫下百脉根代谢组学分析

为了探究百脉根(Lotus corniculatus)在低磷和干旱胁迫下代谢物质的变化,本实验选择对照(CK)、低磷(LP)和干旱胁迫(PEG)三种处理下的百脉根作为实验材料,利用代谢组学对低磷和干旱胁迫下的百脉根进行代谢物的分析。结果表明,干旱胁迫样本共测到390种差异代谢产物,其中314种下调表达,76种上调表达,注释到70条代谢通路。低磷胁迫样本共检测到332种代谢产物发生变化,其中209种下调表达,123种上调表达,注释到58条代谢通路。干旱胁迫样本主要聚类为脂肪酰基、羧酸及其衍生物、有机氧化合物、类黄酮,富集程度最显著的途径为类固醇生物合成。低磷胁迫样本主要聚类为脂肪酰基、羧酸及其衍生物、有氧化合物、类黄酮,富集程度最显著的途径为苯乙烯、二芳庚烷和姜酚的生物合成。研究利用代谢组学方法对百脉根组织部位中的代谢物进行分析鉴定,探究在低磷和干旱胁迫条件下百脉根组织部位中的代谢物以及差异代谢物种类和含量,为以后百脉根非生物胁迫的研究提供数据基础。     

高羊茅胚性愈伤组织的高效诱导及其耐盐突变体筛选

以高羊茅Fine-lawn种子和下胚轴为外植体,分别在诱导培养基D1、D3、D5和D9上培养.下胚轴愈伤组织的出愈率除了在D1培养基上为51.3%外,在其他诱导培养基上均为100%.在D5培养基上继代3个月左右,从下胚轴获得了胚性愈伤组织.取在NaCl浓度为0.5%～3.0%的培养基上生长13 d的高羊茅胚性愈伤组织,分别测定其存活率、相对生长量、鲜干重比和脯氨酸含量.利用直接筛选的方法,将胚性愈伤组织分别放在含1%, 2%和3% NaCl的选择培养基上连续筛选60 d,在1% NaCl浓度下获得了耐盐的胚性愈伤组织并且获得了再生植株.再生植株能够在含有1% NaCl的Hoagland培养液中生长.     

发根农杆菌介导的百脉根的基因转化

本文报道了豆科植物简单有效的转化再生实验系统。百脉根子叶外植体被含发根性Ｒｉ质粒载体的发根农杆菌感染，该载体带有一个ｕｐｔ－Ⅱ基因和一个甘露碱合成酶基因，在含卡那纱的筛选培养基上，外植体能诱导出毛根，并不断生长，毛根诱导频率为４５．５％。切取毛根根段在筛选培养基上培养，毛根能膨大，并分化再生成苗和植株，其再生率为７６７．９％。抗性植株形态正常，浅层根系发达，ＤＮＡ斑点杂交与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明     

9种豆科牧草总黄酮和总皂苷积累规律的研究

黄酮和皂苷不仅是植物中重要的防御性次生代谢产物,而且具有显著的药理和生理活性,对于植物的抗性研究和工业化应用具有重要意义。对鹰嘴紫云英(Astragalus cicer L.)、红豆草(Onobrychis viciaefolia Scop)、百脉根(Lotus corniculatus L.)、小冠花(Coronilla varia L.)、黄花草木樨(Melilotus officinalis(L.)Desr.)和苜蓿(Medicago L.)多种豆科牧草中总黄酮和总皂苷的周年积累规律和分布特点进行研究,以期为豆科牧草建立科学的牧刈制度和合理应用提供理论依据。结果表明:总黄酮和总皂苷在不同属间和品种间的动态变化各不相同;在不同组织中的分布也不同,在整个生育时期,均为叶片中的含量多于茎秆中的。前5种豆科牧草的总黄酮含量显著高于苜蓿,是提取总黄酮的优质材料;红豆草、鹰嘴紫云英、黄花草木樨及苜蓿的总皂苷含量均高于小冠花和百脉根,是提取皂苷产品的优质材料。     

放牧条件下不同牧草品种混播组合的研究

１９９２年１０月至１９９４年１１月，在放牧条件下，对不同牧草混播组合进行了试验研究。试验结果表明，适宜的混播组合为白三叶分别与高狐茅，黑麦草，鸭茅混播，百脉根与黑麦草，鸭茅的组合中，百脉根不能持久存在。在放牧条件下，每年应向人工草地追施适量尿素。     

百脉根ISSR-PCR反应体系的建立与优化

运用L16(45)正交设计对百脉根ISSR反应的5个因素,即DNA模板浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶浓度在4个水平上进行优化实验,通过不同反应体系扩增效果比较,最终确定在20uL体系中各反应物的最适含量为:40ng模板DNA、2μL 10×PCR Buffer、0.15mmol/LdNTPs、0.75μmol/L ISSR引物、1.5mmol/L MgCl2、1UTaqDNA聚合酶。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行百脉根属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

2个百脉根品系种子萌发期的耐盐性评价

为探究2个百脉根（Lotus corniculatus L.）品系B1（来源于加拿大圭尔夫）和B2（引种于加拿大）种子萌发期的耐盐性,采用纸上发芽法,以蒸馏水为对照,采用不同浓度（0.3%,0.6%,0.9%,1.2%）NaCl溶液,通过测定发芽率、根长、苗长等7项指标,计算其盐害系数,利用方差分析、主成分分析以及隶属函数对其进行了综合评价。结果表明：随着盐浓度的增加两个百脉根品系的发芽指数呈现出先升高后下降的趋势,活力指数呈现先降低后升高再降低的趋势,其他指标的变化趋势均不一致。方差分析结果表明,当盐浓度为1.2%时,B2的发芽率、发芽势、发芽指数、苗长和幼苗干重均显著高于B1（P<0.05）。综合评价结果表明,种子萌发期耐盐性较强的是品系B2。     

俄罗斯百脉根种质资源农艺性状鉴定与评价

为挖掘利用优质百脉根种质资源,促进其育种工作,采用田间调查和室内考种分析两种方法,对引进的69份俄罗斯百脉根种质材料的9个农艺性状进行了鉴定和评价。结果表明,69份材料各具特点,差异明显,类型广泛。单株重变异系数最大,为57.58%,变异明显;生育期变异系数最小,仅为6.92%。通过主成分分析,从9个农艺性状中提取出3个主成分因子,即草产量、生育期(成熟)和千粒重,提供的信息量占全部信息量的87.468%。利用这3个主成分因子进行系统聚类,将69份俄罗斯百脉根种质材料划分为三大类群。第Ⅰ类群属晚熟半匍匐中产型材料,第Ⅱ类群属早熟匍匐低产型材料,第Ⅲ类群属中熟直立高产型材料。结果表明,第Ⅲ类群材料综合产量性状最好。     

外源激素对甘草愈伤组织诱导及染色体加倍的影响(简报)

采用不同浓度配比的外源激素NAA、2,4-D和BAP对甘草不同外植体(子叶、下胚轴和胚根)进行愈伤组织诱导、再生苗分化及细胞染色体加倍的研究。结果表明,不同外植体愈伤组织的诱导频率无差异,均以MS 1.0mg/L NAA 1.0 mg/L 2,4-D 1.0 mg/L BAP培养基的诱导频率最高,均达100%。而再生苗分化具有极显著的差异,以下胚轴最好,在MS 3.0 mg/L BAP 2.0 mg/L ZT 10.0 mg/L GA3培养基上获得的再生苗频率最高,为4.57%。另外,不同外植体类型、不同浓度的NAA、2,4-D对愈伤组织细胞倍性的影响不同,其中下胚轴诱导的四倍体频率明显高于子叶和胚根,平均为42.23%;而1.0 mg/L 2,4-D下的子叶、下胚轴和胚根外植体愈伤组织的四倍体加倍率也达到最高,分别为61.25%,60.00%和58.13%。除此之外,细胞染色体加倍频率随着愈伤组织培养时间的延长而增加。