近江牡蛎热休克蛋白 70 基因的原核表达研究

近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)热休克蛋白70(HSP70)家族成员是重要的抗逆和潜在污染预警分子。本研究将近江牡蛎HSP70基因cDNA连接到原核表达载体pQE30中,构建近江牡蛎HSP70的重组表达质粒pQE30/HSP70。该重组质粒经酶切和测序鉴定后,转入表达宿主大肠杆菌M15进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Westernblot分析表明,确实获得了重组蛋白的表达。分别在25℃、30℃和37℃下,经0.2mmol/LIPTG诱导融合蛋白表达,其中,在25℃下,诱导的融合蛋白表达量最高,表明该温度为恰当诱导温度;在25℃下,分别诱导重组蛋白表达2h、4h、6h、8h、12h和16h,其中诱导12h的蛋白表达量最高;大部分融合蛋白以可溶形式存在于大肠杆菌M15中;表达的重组融合蛋白分子量约69kD,并能与鼠源抗6伊His的单克隆抗体特异性结合,表明通过原核表达获得了近江牡蛎HSP70蛋白。实验表明,在25℃下,经0.2mmol/LIPTG诱导表达12h,可获得大量可溶近江牡蛎HSP70蛋白。     

盐度骤降对近江牡蛎和长牡蛎能量收支的影响

采用实验生态学方法,研究了盐度骤降(盐度分别为10、20,自然海水为对照组)对近江牡蛎(Crassostreaariakensis)和长牡蛎(Crassastreagigas)生理代谢的影响.结果显示,盐度骤降对长牡蛎和近江牡蛎的耗氧率(OR)、排氨率(NR)、排粪率(FER)均有显著影响(P＜0.05),且2种牡蛎对...     

刺参体腔细胞免疫相关基因对溶藻弧菌感染的响应

为探讨分离自患病刺参(Apostichopus japonicus)的一株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染刺参后,刺参体腔细胞免疫相关基因的响应变化,分别给刺参注射100μL生理盐水(对照组)和1×10⁹ CFU/mL溶藻弧菌菌液(实验组),用荧光定量PCR技术,检测24 h内刺参体腔细胞Lys、Rel和p105基因表达的变化。结果表明,注射生理盐水对刺参体腔细胞Lys、Rel和p105基因表达量无显著影响。感染溶藻弧菌后,实验组刺参体腔细胞中溶菌酶基因的表达量在24 h显著升高,且1 h和24 h时的表达量显著高于对照组(P<0.05);刺参体腔细胞中p105基因在感染后表达量呈上升趋势,3 h达到峰值,在3 h和6 h, p105基因的表达量显著高于对照组(P<0.05);刺参体腔细胞Rel基因表达量在感染后无显著变化。可见刺参感染溶藻弧菌后其体腔细胞Lys和p105基因的表达在短时间内迅速响应。     

太平洋牡蛎与近江牡蛎的种间杂交

为了评估太平洋牡蛎与近江牡蛎能否产生远缘杂种优势,于2010年5月,以成熟的两种牡蛎亲本为材料开展了2×2远缘杂交研究,由长牡蛎自繁组GG(Crassostrea gigas♀×C.gigas♂)、近江牡蛎自繁组AA(C.ariakensis♀×C.ariakensis♂)、正交组GA(Crassostreagigas♀×C.ariakensis♂)、反交组AG(C.ariakensis♀×C.gigas♂)4个实验组组成。分析了子代早期表型性状和杂种优势,并对杂交子代进行了遗传鉴定。结果表明:GA杂交组与AG组的受精强度具有不对称性。幼虫浮游期间,表型性状的中亲杂种优势几乎为0,GA组生长与存活性状表现出积极的单亲杂种优势,而AG组则具有明显的远交衰退现象;幼虫早期表型性状受到母本效应影响,而后减弱。变态期间,GA组变态率较高,得到了大量杂交稚贝;而AG组变态率极低,仅获得了72个杂交稚贝。稚贝培育期间,稚贝表现出中亲生长劣势与存活优势;GA组具有明显的单亲生长与存活优势,而AG组则表现出生长劣势并具有一定程度的存活优势。利用复合COI及ITS2鉴定了种间杂交子结果表明:正反交组杂交子均为真正意义上的两性融合杂交子。实验获得了具有显著杂种优势的GA组杂交子,为现有牡蛎的遗传改良提供了新的方向。     

近江牡蛎受精过程、胚胎及早期幼虫发育特征

为了解近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)从受精到早期幼虫发育阶段的发育特性,在水温22～24℃、盐度20～22的实验室环境中对采自山东东营丁字湾海域的近江牡蛎进行人工授精,利用普通光学显微镜和荧光显微镜对近江牡蛎受精、早期胚胎和幼虫发育过程中的形态和核行为变化进行观察,并对这一过程中牡蛎的壳长变化进行了统计分析。结果表明,近江牡蛎成熟的未受精卵呈梨形,卵径为50μm左右,核相处于第一次成熟分裂中期。受精卵在受精后15～20 min、25～30 min,先后排出第一、第二极体,完成第一次和第二次成熟分裂,在受精后30 min左右先后形成雄原核和雌原核;雌、雄原核各自形成染色体组,在卵子中央发生联合,染色体排列于赤道板上,形成第一次有丝分裂的中期分裂相;受精后45 min左右,受精卵进行第一次卵裂,形成2个体积不等的卵裂球;受精75 min后,受精卵开始第二次卵裂,90 min后形成4个卵裂球,进入4细胞时期;6 h后受精卵发育至桑葚期,8～10 h进入囊胚期,12～15 h后发育至担轮幼虫,27～30 h左右发育成D形幼虫,5 d左右进入壳顶幼虫时期,17 d后幼虫...     

防城港市近江牡蛎产业台风灾害风险防控建议

论述了台风灾害给防城港市近江牡蛎产业带来的风险,提出了养殖的防控建议。     

近江牡蛎和长牡蛎的配子兼容性及合子育性

为了评估长牡蛎(GG)和近江牡蛎(AA)的配子兼容性和合子育性,本实验探究了盐度(16、20、24、28和32)、温度(18、21、24、27和30 ℃)和精子浓度(10⁰、10¹、10²、10³和10⁴个/μL)对受精率、胚胎畸形率和孵化率的影响。结果显示,随盐度的增加,GG组的受精率和孵化率逐渐上升,而AA组和AG组的受精率和孵化率先上升后下降;GA组和AG组分别在盐度28和24时具有较优的配子兼容性和合子育性,受精率、畸形率、孵化率分别为7.45%±5.05%、2.00%±0.90%、63.60%±9.88%和14.26%±9.26%、1.74%±0.93%、66.16%±9.43%。随温度上升,AA、GA和GG组的受精率和孵化率先升高后下降,而畸形率先下降后上升;GA组和AG组均在27 ℃时表现出较优的配子兼容性和合子育性,此时GA组和AG组的受精率、畸形率、孵化率分别为7.95%±4.04%、1.79%±1.04%、57.11%±9.95%和14.70%±7.27%、1.66%±0.85%、67.25%±15.19%。随精子浓度的增加,GG组的受精率逐渐上升,孵化率逐渐下降,GA组和AG组的受精率逐渐上升;GA组和AG组均在10⁴个/μL时表现出较优的配子兼容性和合子育性,此时二者的受精率、畸形率、孵化率分别为9.09%±7.53%、1.59%±0.48%、67.97%±19.96%和14.30%±6.04%、1.06%±0.68%、67.33%±12.65%。研究表明,温度、盐度和精子浓度对长牡蛎和近江牡蛎种间配子兼容性影响较小,但对合子育性影响较大。     

牡蛎中副溶血弧菌荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

以副溶血弧菌毒素调控基因(toxin regulations,toxR)作为靶标基因,设计特异性引物及TaqMan探针,以含toxR基因的质粒为模板,建立质粒拷贝数与CT值的标准曲线,分别采用含toxR基因质粒、纯培养的副溶血弧菌和添加副溶血弧菌的牡蛎(Ostrea)模拟样品进行灵敏度试验,结果表明,其灵敏度分别为15拷贝、18 CFU/mL和180CFU/mL.同一个样品的30次重复性试验表明,试验内及试验间的变异系数分别为0.95%和1.5%.结果显示,本研究建立的副溶血弧菌荧光定量PcR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于牡蛎等水产品中副溶血弧菌的定量检测.     

溶藻弧菌溶血素基因反向PCR克隆及其原核表达

溶藻弧菌的胞外产物(ECP)在其致病过程中发挥重要作用,已经观察到溶藻弧菌ECP所致的溶血现象,关于溶藻弧菌溶血素的种类和其对溶藻弧菌的致病性贡献的报道非常稀少。本文利用已经报道的多种弧菌溶血素基因序列设计通用引物,检测溶血素基因在溶藻弧菌中的分布,发现96个菌株中有74株扩增出溶血素基因(vah)片段。对致病株ZJ0451的 vah片段测序。根据已测得的片段序列设计引物,通过反向PCR扩增及后续克隆测序获得全长vah基因及部分侧翼序列。经比对证实溶藻弧菌vah与多种弧菌的TLH类溶血素高度相似,且其肽链N端有信号肽。利用pET32a载体构建了两种包含不同长度融合标签的vah表达载体,并均在大肠杆菌BL21(DE3)中获得可溶性表达。在26℃的诱导温度下,9h时vah表达量达到相对最大。在原核表达系统中,vah蛋白信号肽可以被切除。     

近江牡蛎（Crassostrea hongkongensis）家系早期发育生长比较

选取数量性状有较大差异的6个近江牡蛎（Crassostrea hongkongensis）作为亲本,成功建赢了9个半同胞家系,并对各个家系的受精、孵化、成活和早期生长的情况进行比较。结果显示,各家系子代的受精率、9孵化率和成活率均受亲本成熟度的影响;各家系的早期生长中,家系CH1、CH4和CH7的生长率大于其他家系;近江牡蛎幼虫的早期生长阶段受母本效应影响明显。     

Cloning and expression of the gene encoding an extracellular alkaline serine protease from Vibrio alginolyticus strain HY9901, the causative agent of vibriosis in Lutjanus erythopterus (Bloch)

A 750-bp internal fragment of the alkaline serine protease gene (asp) from the Vibrio alginolyticus strain HY9901 was amplified by polymerase chain reaction (PCR). The flanking sequences of the 5'- and 3'- ends of the asp gene were characterized by reverse and nested PCR. Sequence analysis showed that the asp gene contained an 1893-bp ORF encoding 630 amino acids. The deduced amino acid sequence of the ASP (alkaline serine protease) precursor showed significant homology with several bacterial alkaline serine proteases. Expression of the asp gene in Escherichia coli and activity tests of the ASP indicated that the N-signal peptide of the ASP precursor was essential to autocatalyse and fold correctly the enzyme to obtain activity. The purified ASP was lethal for Lutjanus erythopterus with an LD(50) of 0.25 microg protein g(-1) body weight.     

岩牡蛎正常和低盐胁迫下定量PCR内参基因的筛选与验证

实时荧光定量 PCR 已广泛用于基因表达的分析,合适的内参基因选择是获得准确分析结果的关键。本研究选用正常生理状态下岩牡蛎(Crassostrea nippona)的鳃、外套膜、闭壳肌和内脏团 4 种组织以及盐度 10、20 和 30暂养 1 周后的鳃组织为材料,对已报道的常见内参基因(EF1A、GAPDH、RO21、TUB 和 TUA)的稳定性通过 3 种方法(geNorm、NormFinder 和 BestKeeper)进行分析和筛选,发现针对鳃单一组织在不同盐度胁迫下, GAPDH 和RO21 可以作为合适内参基因,而在不同组织中,需要更多的内参基因联合分析才能获得准确的定量表达结果。本研究是首次利用 q-PCR 对岩牡蛎进行内参基因的筛选和验证,为今后该物种低盐胁迫相关的基因表达和功能基因的研究提供重要依据。     

溶藻弧菌感染后凡纳滨对虾鳃组织免疫相关基因的表达

分别给凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)注射生理盐水、3×10⁶ CFU/mL(低浓度组)和9×10⁶ CFU/mL(高浓度组)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)菌液, 采用荧光定量PCR技术, 检测不同处理后凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体、IMD和溶菌酶基因表达量随时间的变化。结果表明, 处理42 h内, 注射生理盐水组对虾的Toll受体和IMD mRNA表达量无显著变化, 溶菌酶mRNA表达量在注射36 h后显著升高。急性感染溶藻弧菌后, 凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA的表达量峰值分别出现在感染后24、42和36 h; 溶藻弧菌的感染剂量不影响上述基因表达峰值的出现时间, 但显著影响上述基因的表达峰值(P<0.05), 各基因表达量峰值由大到小均依次为高浓度组、低浓度组、生理盐水组。急性感染初期, 对虾鳃组织中Toll受体mRNA表达量呈现显著下调, 而IMD和溶菌酶mRNA表达量在感染初期不存在显著下调现象。与感染前各基因的表达量相比, 高浓度溶藻弧菌感染组Toll受体mRNA表达量在2 h时显著下调, 低浓度溶藻弧菌感染组Toll受体mRNA表达量在3 h显著下调(P<0.05); 高浓度组IMD和溶菌酶mRNA表达量分别在36 h和12 h时开始有显著上调, 而低浓度组IMD和溶菌酶mRNA表达量则分别在42 h和24 h才有显著上调(P<0.05)。表明溶藻弧菌感染对凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量有显著影响, 各基因的表达量与感染进程及溶藻弧菌剂量存在一定的相关性。

     

广西茅尾海的香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)在不同养殖区的性腺发育变化

为探究香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)的繁殖特性以及春季死亡原因,采用肉眼观察、活体镜检和组织切片方法研究了茅尾海沙井的香港巨牡蛎苗种吊养于大风江黄场的1龄牡蛎的性腺发育周年变化,并建立了快速判断香港巨牡蛎性腺发育程度的方法.对比分析了吊养在茅尾海沙井、大风江入海口内的黄场和入海口外的鑫丰场的2龄牡蛎性腺发育的启动和发展过程.结果显示,广西茅尾海的香港巨牡蛎每年只有1个繁殖周期,性腺发育过程可划分为未分化期(1-3月)、分化期(4月)、成熟排放期(5-10月)及休止期(11-12月)4个阶段;1龄和2龄牡蛎的性腺发育基本同步;大风江入海口外的牡蛎的性腺发育较入海口内的牡蛎提前约15d,而比茅尾海内海的牡蛎提前约30 d,入海口外的牡蛎的性腺4月即发育到成熟排放期,冬季饵料的丰富程度和温度、盐度等因素可能是造成这种差异的原因.研究还发现,高温少雨天气下,海水盐度高,抑制了牡蛎性细胞的排放,导致入海口外侧吊养牡蛎的大规模死亡,濒临死亡的牡蛎性腺处于退化和崩解状态.鉴于此,认为4月初即需密切监测吊养于入海口外的牡蛎性腺的发育状况和天气状况,及时收获性腺饱满的牡蛎,或将吊养牡蛎的蚝排放置在河流入海口内区域过冬.     

低温胁迫对尼罗罗非鱼水通道蛋白(Aquaporin 1，AQP1)基因(AQP1)表达的影响

以经过连续多代抗寒选育获得的尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)耐寒品系为实验材料, 克隆了尼罗罗非鱼水通道蛋白基因(AQP1)的cDNA序列, 并采用实时荧光定量PCR分析方法探讨了低温胁迫对罗非鱼AQP1基因表达水平的影响。序列分析结果显示, 尼罗罗非鱼AQP1 cDNA长度为1 098 bp, 包含36 bp的5′端非翻译区序列、783 bp开放阅读框(ORF)和279 bp的3′非翻译区序列, 编码261个氨基酸。氨基酸序列比对表明, 各物种间AQP1序列的同源性较高(96%~59%)。聚类分析表明, 尼罗罗非鱼首先与同属鲈形目丽鱼科的斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)聚在一起, 再与其他硬骨鱼类聚为一类。实时荧光定量PCR 结果表明: 在水温从30℃逐渐降到10℃过程中, 肌肉和肝组织AQP1基因的表达量从20℃开始均逐渐下调。其中肌肉组织中, 与30℃时的表达量相比, 耐寒品系在20℃时表达量大幅度下调, 当水温为15℃时, 其表达量下调幅度为22.16倍。当水温降到10℃时, 其表达量下调了107.73倍。而对照组AQP1基因的表达量在15℃时, 下调幅度为5.38倍。当水温达到10℃时, 其表达量下调幅度为11.30倍。结果分析显示, 耐寒品系与对照组AQP1基因在低温条件下的表达量存在显著性差异(P<0.05)。而在肝组织中, 当水温降到15℃时, 耐寒品系和对照组的表达量下调幅度分别为3.38倍、1.42倍。水温降到10℃时, 其表达量上调幅度分别为18.85倍、9.01倍。结果分析表明, 低温条件下耐寒品系与对照组AQP1基因在肝组织中的表达差异不显著(P>0.05)。结果表明, AQP1表达对温度敏感, 耐寒品系较高的耐寒能力与其在低温条件下的肌肉组织大幅上调表达有关。由此可见, AQP1基因在罗非鱼低温适应过程中发挥重要作用, 是潜在的研究罗非鱼耐寒机制的候选基因之一, 本研究为进一步研究罗非鱼的耐寒分子机制和开展鱼类抗逆育种提供参考。

     

合浦珠母贝热休克蛋白hsp70基因的克隆与表达分析

采用同源克隆和RT-PCR技术对合浦珠母贝(Pinctada fucata)热休克蛋白hsp70基因进行了克隆和表达分析。获得cDNA全长序列2 365 bp,其中3’非编码区域(UTR)为318 bp,5’UTR为88 bp,开放阅读框(ORF)为1 959 bp,编码652个氨基酸,分子量约为71.39 kD,理论等电点为5.22,并含有3个HSP70家族的签名序列IDLGTTYS、DLGGGTFD和EEVD。同源性分析表明,合浦珠母贝HSP70的氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)等双壳贝类的相似性高达86%以上,基于氨基酸序列的聚类分析表明,合浦珠母贝与牡蛎属种类亲缘关系最近。高温、高盐刺激后,半定量RT-PCR检测发现hsp70基因的表达明显增加,高温刺激的表达量高于高盐刺激,高温刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、消化腺、外套膜、肌肉、性腺,高盐刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、外套膜、肌肉、消化腺、性腺,表明HSP70参与了机体对刺激的应答过程。该基因的克隆为进一步深入研究合浦珠母贝的抗逆机理及其遗传改良奠定了重要基础。