稻曲病菌分离技术的初探

用7种培养基和2种分离方法对稻曲病菌的培养及分离技术进行了研究。结果表明,胁本哲氏培养+抑制细菌生长的氯霉素(50 μg/mL)是分离稻曲病菌最适宜的培养基。稻谷是厚垣孢子产生的理想培养基。厚垣孢子悬液法可用于稻曲病菌的快速分离,而稻曲球不同层次组织块分离法可从保存长时间的稻曲球分离到稻曲病菌。     

水稻幼穗响应稻曲病菌毒素胁迫早期的转录组分析

【目的】由稻曲病菌引起的稻曲病不仅造成水稻减产,而且还会产生对动物和植物有毒的真菌毒素。探明水稻幼穗对稻曲病菌毒素胁迫响应的分子机制,可为发掘水稻抗稻曲病基因以及抗病分子育种开辟新的思路。【方法】用稻曲病菌毒素处理水稻幼穗,采用转录组测序技术对水稻幼穗进行转录组测序,以水稻9311基因组作为参考基因组进行对比,利用TPM法计算基因表达量,设定参数（差异倍数的绝对值不小于2,且q值不大于0.05）筛选差异表达基因。结合基因差异表达分析、富集功能分析,鉴定水稻响应胁迫的关键基因,并利用实时荧光定量PCR技术对差异表达基因进行验证。【结果】在稻曲病菌毒素胁迫12 h后,水稻幼穗出现2526个差异表达基因（DEG）;通过GO富集、KEGG代谢途经和KOG功能分析,将差异基因划分为GO功能下的64个条目、32个代谢途径和KOG功能下23个类别,包括淀粉和蔗糖代谢、苯丙类生物合成、碳代谢、糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸糖代谢等生物学过程。DEG中有66个植物转录因子,分属7种植物转录因子家族,包括WRKY和Myb两大转录因子。分析二萜类生物合成与淀粉和蔗糖代谢途径相关基因发现,OsCPS2、OsKSL4和细胞色素P450等基因表达量上调,而淀粉酶、β-呋喃果糖苷酶和UDP-焦磷酸化酶等基因表达量下调,推测这些基因在水稻响应稻曲病菌毒素胁迫时发挥重要的作用。【结论】稻曲病菌毒素作为非生物胁迫因素对水稻幼穗具有毒性;通过干扰淀粉和蔗糖代谢等途径而影响种子营养物质的合成,降低水稻抵抗病原菌侵染水稻的能力。     

稻曲病初侵染源及病菌侵染适期初步研究

2006-2007年针对稻曲病初侵染源及病菌侵染适期进行了田间试验,结果表明:稻曲病初侵染源主要为种子带菌,其次是土壤中越冬的病菌;病菌侵染适期为孕穗中、后期,自然病菌比人工培养病菌致病力更强;破口至齐穗期较多的降雨天气有利于稻曲病发生.     

稻曲病菌侵染循环及其分生孢子致病作用的研究进展

稻曲病是一种由Ustilaginoidea virens (cooke) Takahashi侵染引起的水稻穗部病害,在中国广泛发生。被稻曲病侵染后,水稻产量与品质会受到严重影响。研究稻曲病菌侵染水稻的过程及其致病机制,将为稻曲病的防治提供理论依据。介绍了稻曲病菌侵染过程及侵染循环、分生孢子的形成和萌发及其相关基因以及稻曲病菌与水稻分子互作机制等方面的研究进展,并就进一步深入研究提出了建议。     

根癌农杆菌介导遗传转化稻曲病菌

利用根癌农杆菌介导转化系统,通过潮霉素抗性筛选转化子,对稻曲病菌分生孢子进行了转化。农杆菌经乙酰丁香酮预先诱导,转化效率大约为390~450个转化子/ 106个孢子。PCR检测绿色荧光蛋白基因和潮霉素基因表达盒,结果显示被测转化子基因组中均成功整合了目的基因片段。同时,在488 nm下这些转化子都具有荧光。表明利用根癌农杆菌可以成功转化稻曲病菌。     

稻曲病菌分生孢子实时PCR定量检测方法的建立及初步应用

 根据稻曲病菌核糖体转录间隔区（ITS）序列的特异性,设计了2对引物及相应TaqMan探针用于建立稻曲病菌实时PCR定量检测技术。结果表明,uvr292rf/uvr397rr/uvrp333组合建立的体系可特异性检测出稻曲病菌,扩增基线平整,指数扩增期明显,重现性好,最低可检出24 fg的稻曲病菌基因组DNA模板量;以梯度稀释分生孢子液提取的基因组DNA为模板,建立孢子数量常用对数值与Ct值的线性关系,理论上最低可检测出0.67个分生孢子。对3个时间点的田间孢子捕捉样品进行检测,结果显示不同月份间稻曲病菌孢子数量存在差异。     

多个稻曲病菌效应因子的信号肽验证和表达分析

【目的】信号肽对效应因子的分泌至关重要,影响病原微生物的致病进程。前期鉴定到在稻曲病菌侵染水稻花器官过程中显著上调表达的10个效应因子基因,但这些效应因子是否含有功能性信号肽及其表达模式尚不明确。【方法】利用SignaIP-5.0数据库预测、烟草瞬时表达系统和酵母信号肽分泌实验,分析并鉴定这些效应因子的信号肽。利用实时荧光定量PCR技术,检测效应因子基因的表达模式。【结果】UV＿44、UV＿1548、UV＿1567等10个稻曲病菌效应因子均含有信号肽。烟草瞬时表达结果显示,含有信号肽的eYFP融合蛋白在细胞质壁分离后均能分泌到质外体空间。酵母菌信号肽分泌结果显示,分别携带这10个信号肽的酵母菌株可在以棉子糖为唯一碳源的培养基上生长,且与TTC发生显色反应。实时荧光定量结果表明,除了UV＿6754,其余9个效应因子基因的表达模式不尽相同,其中UV＿44、UV＿1567、UV＿3667、UV＿4213、UV＿4989、UV＿5215和UV＿8184的表达量在接种后显著升高。【结论】这10个稻曲病菌效应因子均含有分泌功能的信号肽,编码效应因子的基因在稻曲病菌侵染过程中具有不同的表达模式。该结...     

实时荧光定量PCR筛选稻曲病菌内参基因

 通过实时定量PCR分析了稻曲病菌中5个传统内参基因18S rRNA、GAPDH、ubiquitin、β actin、α tubulin的mRNA差异表达情况,并利用geNorm软件分析了它们在4个发育时期和NaCl胁迫处理中的表达稳定性。结果表明,在菌龄为7 d、8 d、9 d、10 d的稻曲病菌中,α tubulin 2和β actin表达稳定;在0.4 mol/L  NaCl溶液处理0 h、4 h、8 h、12 h、16 h后,β actin和α tubulin 2表达稳定。因此,当利用荧光定量PCR分析比较稻曲病菌基因表达差异时,可选择α tubulin和β actin作为内参基因。     

稻曲病菌UvHog1基因的克隆及表达分析

稻曲病由稻曲病菌引起,是水稻穗部的重要病害。利用同源克隆和RACE技术,根据丝状真菌相对保守的氨基酸序列设计简并引物,从稻曲病菌中分离了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)编码基因的全长cDNA序列,命名为UvHog1。UvHog1含有MAPK保守的蛋白激酶激活域(TGY),序列与稻瘟病菌MgOsm1(AAF09475.1)、球孢白僵菌BbHog1(AAS77871.1)、烟曲霉AfOsm1(XP752664.1)和隐球酵母CrHog1(AAM26267.1)等MAPK高度同源,相似性分别为95%、93%、88%和81%。系统聚类结果表明,UvHog1与酵母Hog1MAPK同源。在盐胁迫条件下,UvHog1的相对表达量明显降低,表明UvHog1参与了对盐胁迫的信号响应。     

稻曲病菌休眠与非休眠厚垣孢子胞壁多糖结构与组分

 为揭示稻曲病菌厚垣孢子壁与厚垣孢子内源性休眠的关系,以典型的休眠型(黑色)和非休眠型(黄色)稻曲病菌厚垣孢子为材料,用液氮研磨,超声破壁后,经复合酶 热水浸提 Sevag法提取胞壁多糖,采用紫外光谱、红外光谱、刚果红实验、气相色谱分析其多糖的结构和组分。结果表明,黑色、黄色厚垣孢子胞壁多糖均含β型吡喃糖苷键,具有三股螺旋构象,为主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖3种单糖组成的杂多糖,黄色厚垣孢子中含有少量的木糖;黑色厚垣孢子壁中葡萄糖、半乳糖和甘露糖的摩尔百分比为58.23∶25.32∶16.46,黄色厚垣孢子壁中葡萄糖、半乳糖、甘露糖和木糖的摩尔百分比为3548∶30.58∶24.46∶9.45。这两种厚垣孢子壁多糖的组成和比例有明显差异,可能与厚垣孢子休眠有关。     

氢化物发生-原子荧光光谱法测定人参中砷和锑

目的研究氢化物发生一原子荧光光谱法的同时测定人参中砷和锑的含量。在仪器的最佳工作条件及氢化物发生条件下,还探讨了还原剂及其用量与还原掩蔽剂对测定的影响。方法采用氢化物一原子荧光光谱法进行测定。结果在测定条件下,砷的线性范围为0—10μg／L,r=0．9998,检出限为0．06μg/L,回收率102．3％,精密度（RSD）为3．45％;锑的线性范围为0-10μg／L,r=0．9999,检出限为0．027μg／L,回收率94．7％,精密度（RSD）为4．72％。用该法测定了标准物质茶叶中砷和锑的含量以进行比较,结果与推荐值相吻合。结论方法快速、准确,应用于人参中砷和锑的检测,获得较满意结果。     

离子色谱法测定茶叶中的硝酸盐和亚硝酸盐

建立了离子色谱法测定茶叶中硝酸盐和亚硝酸盐的分析方法。样品经超声提取后,用PVPP吸附和固相萃取柱净化的方法进行前处理,经高容量阴离子交换柱分离,抑制型电导检测器检测。结果表明,样品中硝酸盐和亚硝酸盐的回收率范围分别为88.6%~107.5%和89.3%~101.2%。相对标准偏差（RSD）为1.67%和1.13%。离子色谱法测定硝酸根和亚硝酸根具有操作简便、测定快捷、准确性高的优点。     

基质固相分散-反相高效液相色谱测定茶叶中苯脲类除草剂残留

建立了基质固相分散萃取(matrix solid phase dispersion,MSPD)-反相高效液相色谱(reversed phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)检测利谷隆、灭草隆、敌草隆和绿麦隆4种苯脲类除草剂的新方法。茶叶样品与C18填料混合碾磨后与中性氧化铝一起装柱,二氯甲烷为淋洗剂,使样品的萃取与净化一步完成。讨论了MSPD法和色谱分析的各种影响因素,最佳实验条件下灭草隆在0.01～10.00 mg/L范围内线性关系良好,检测限为5μg/L;绿麦隆、敌草隆和利谷隆在0.025～10.00 mg/L范围内线性关系良好,检测限为10μg/L。4种除草剂在茶叶样品中的回收率在83.5%～100.4%之间,相对标准偏差小于7.1%。该方法简单、快速、干扰少、回收率高,符合茶叶中除草剂残留分析要求。     

茶叶中7种除草剂农药残留气相色谱-串联质谱测定

建立了加速溶剂萃取提取(ASE),凝胶净化系统净化(GPC)样品前处理,气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)测定茶叶中7种除草剂农药残留量.茶叶样品用乙腈溶剂经ASE提取,GPC净化,乙酸乙酯/环己烷(等体积比)淋洗.GC-MS/MS采用多反应监测模式(MRM).结果表明,在添加农药标准0.010、0.100μg/...     

超高压液相色谱-串联质谱法测定养殖水中沙丁胺醇、双酚A、甲基睾酮、甲地孕酮、已烯雌酚的残留

建立了养殖水中沙丁胺醇、双酚A、甲基睾酮、甲地孕酮、已烯雌酚的液相色谱-电喷雾串联质谱测定方法。样品经自动固相萃取仪进萃取净化后，以BEHC18超高效液相色谱柱，乙腈及超纯水为流动相分离，以电喷雾离子源正离子多反应监测模式下进行了测定。结果表明：在5-50μg/L的范围内沙丁胺醇、双酚A、甲基睾酮、甲地孕酮、已烯雌酚均成线性，回收率范围在80%-120%之间，方法的检出限和定量限范围均不高于0.1μg/L。该方法前处理简单、快速、灵敏度高，适用于养殖水或地表水中沙丁胺醇、双酚A、甲基睾酮的检测。     

聚丙烯酰胺凝胶电泳快速检测大豆过敏原蛋白Gly m Bd30K缺失方法

通过对现有SDS-PAGE电泳技术的样本前处理和制胶技术的改良,开发出了一种能够同时清晰鉴别7S球蛋白组分亚基(α',α,β-Subunit)和Gly m Bd 30 K谱带的SDS-PAGE电泳快速检测新技术.利用该方法对PI603570A×0329F6杂交组合F2群体的116个样本进行了7S球蛋白组分亚基(α',α...     

杂交竹枯萎病菌室内药剂筛选

为了筛选出适合大田使用的高防效低成本的药剂来防治杂交竹枯萎病菌,采用菌丝生长速率法和抑制孢子萌发法对13种农药进行室内毒力测定并对测定结果进行综合分析,结果显示参试药剂中A、C、 D、G、H、I、K和M等对杂交竹枯萎病菌有较强的抑制作用,为今后杂交竹枯萎病大田药效试验提供一定的理论依据。     

超高效液相色谱-串联质谱法检测绿茶中16种农药残留

建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）同时检测绿茶中16种农药残留的分析方法。采用1%甲酸乙腈提取绿茶样品中的目标农药,经TPT-SPE柱净化,在电喷雾正离子源（ESI⁺）模式下电离,质谱多反应监测模式（MRM）对目标母离子和子离子进行扫描测定。通过对样品提取、净化以及色谱条件优化,目标农药浓度范围在0.005~1.000 mg·kg^-1线性良好,相关系数R²>0.992 6;在0.010、0.050、0.100 mg·kg^-1和1.000 mg·kg^-1 4个添加水平下,平均回收率在74.0%~105.4%,相对标准偏差（RSD）<20.0%;方法的定量限为10~50 μg·kg^-1。该方法分析速度快,灵敏度高,各项技术指标均符合国内外相关法规标准,可满足绿茶中多种农药残留同时检测的要求。     

超高效液相色谱-串联质谱法测定香蕉中吡虫啉和高效氯氰菊酯

建立了香蕉中吡虫啉和高效氯氰菊酯多残留分析方法。样品经1%乙酸乙腈提取,N-丙基乙二胺(PSA)和石墨化炭黑(GCB)净化,以甲醇和2mmol/L乙酸铵水溶液为流动相,进行梯度洗脱分离,采用电喷雾正离子源模式(ESI+),多反应监测(MRM)采集数据,基质匹配外标法定量。吡虫啉和高效氯氰菊酯在0.001～0.1mg/L范围内线性关系良好,相关系数r> 0.9991,方法检出限(LOD)为1 pg,定量限(LOQ)为0.01 mg/kg。在0.01、0.05、0.10 mg/kg3个添加水平下,吡虫啉和高效氯氰菊酯在香蕉中的回收率为84.91%～104.78%,相对标准偏差(RSD)为1.23%～9.69%。该法操作简单、灵敏度高、重现性好,适用于香蕉中吡虫啉和高效氯氰菊酯的残留量测定。     

固相萃取法与QuEChERS法对比检测无核荔枝中19种农药残留

建立了气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法同时测定无核荔枝中19种农药残留的分析方法。实验考察了固相萃取法和QuEChERS法中影响净化和萃取效果的各个因素,同时对二者的基质效应进行分析。结果表明:19种农药的线性范围在0.01~0.5μg/mL,相关系数均大于0.99。在0.01、0.1、0.5 mg/kg加标水平下,采用固相萃取净化时,19种农药的平均回收率为67.0%~95.6%,RSD为2.5%~12%。采用QuEChERS净化时,19种农药的平均回收率在68.2%~125%,RSD为2.8%~12.7%。2种方法在灵敏度和精密度方面无显著差异,均符合农药残留分析要求。但固相萃取较QuEChERS基质效应小,净化相对彻底。QuEChERS较固相萃取具有简单、快速、环保等优点。2种方法均能对荔枝样品进行检测,且数据准确可靠。