洋葱伯克霍尔德菌0107产脂肪酶发酵条件优化研究

[目的]对洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）0107产脂肪酶发酵条件进行优化。[方法]探讨碳源、氮源、诱导物和pH值等条件对产脂肪酶的影响。[结果]较为合适的培养基组成为玉米粉1.50%,蛋白胨1.50%,橄榄油1.00%,K2HPO40.20%,MgSO40.05%。较优化的培养条件为：起始pH值9.0,30℃培养60h,酶活达9.15U/ml,与初始相比酶活提高1.7倍。酶的最适pH值和温度分别为8.5和所60℃,70℃保温2h酶活稳定,这些性质都有利于对动植物油脂的转酯化。[结论]该研究为洋葱伯克霍尔德菌0107所产酶的广泛应用奠定了基础。     

铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因的原核表达

[目的]对铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因进行原核表达。[方法]利用PCR方法从铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增得到脂肪酶基因,测定其核苷酸序列,利用基因重组技术构建脂肪酶基因的原核表达载体,加IPTG至终浓度为1.0 mmol/L诱导蛋白表达4 h,并进行SDS-PAGE电泳。[结果]从铜绿假单胞菌中克隆的脂肪酶基因成熟肽的序列,与NCBI上所递交的铜绿假单胞菌脂肪酶序列同源性很高,达99.36%。成功构建了脂肪酶基因的原核表达载体pET32a-Lip,进一步SDS-PAGE电泳结果显示目的基因得到高效表达。[结论]克隆的铜绿假单胞菌脂肪酶带有自身的信号肽,也可以在大肠杆菌中正常表达,可以用于进一步的研究。     

沼泽红假单胞菌培养基的优化研究

为有效促进沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的生长和繁殖,采用单因素试验和正交试验对其培养基配方进行了优化,结果显示,最佳培养基组成配方为:乙酸钠3.8g/L,氯化铵1.3g/L,酵母膏0.7g/L,微量元素0.8 mL/L。在此条件下培养,沼泽红假单胞菌菌液D_(660nm)值可达2.186,比优化前提高了29.4%。     

沼泽红假单胞菌产类胡萝卜素发酵条件优化

利用单因素试验与正交试验的方法,对沼泽红假单胞菌B9(Rhodopsedomonas palustris B9)产类胡萝卜素培养基和培养条件进行优化。结果表明:最佳培养基成分为:KH2PO40.6g,K2HPO40.9g,酵母膏1.5 g,蛋白胨2.3g,MgSO40.2g,CaCl20.3g,NaCl0.5g,最佳培养条件为:接种量为8%,温度为26℃,pH值为自然pH值。培养7d后,类胡萝卜素产量可达2.863mg·g-1(以干重计)。     

大蒜提取物对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用

研究大蒜提取物对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)生物膜形成的抑制作用。用结晶紫染色法以及光学显微镜对该菌产生的生物膜进行了研究,苯酚硫酸法测定其胞外多糖的产量,采用多孔板法研究了大蒜提取物与山梨酸钾的协同作用。结果表明,大蒜提取物浓度为100、150 mg/mL时,对生物膜的抑制率分别为27.6%和38.7%;对胞外多糖抑制率分别为4.5%和12.6%;100 mg/mL的提取物与山梨酸钾具有协同作用。因此,大蒜提取物对荧光假单胞菌生物膜的形成具有抑制作用。     

一株变形假单胞菌吸附模拟废水中Cd(Ⅱ)的条件

本文研究了理化因素对变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)C-18吸附Cd(Ⅱ)的影响,并通过正交实验确定了最佳吸附条件。结果表明:在吸附剂浓度1.2 g/L、Cd(Ⅱ)初始浓度100 mg/L、pH7.0、温度30℃、转速200 r/min的条件下,吸附12 h,菌株C-18对Cd(Ⅱ)的吸附率和吸附量分别达到88.8%和74 mg/g。在金属离子Zn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)、Ag(Ⅰ)共存的条件下,菌株C-18对Cd(Ⅱ)的吸附效果明显受到影响,4种金属离子对菌株C-18吸附Cd(Ⅱ)的影响顺序为Cu(Ⅱ)Zn(Ⅱ)Pb(Ⅱ)Ag(Ⅰ)。     

基于16S rDNA序列的4株假单胞菌属细菌的分子鉴定

对分离自养殖水环境的4株假单胞菌属细菌的16S rDNA序列进行PCR扩增并测定其核酸序列,在Gen-Bank中通过BLAST查找其同源序列,应用MegAlign软件中的Jotun Hein、Clustal V、Clustal W 3种方法进行序列差异和同源性分析,分别使用Mega 4.0软件中的邻接法(N-J)、最小进化法(ME)、最大简约法(MP)、非加权组平均法(UPGMA)构建系统发育树。3种序列分析方法结果显示,由Jotun Hein法可知,菌株T3与菌株T6序列相似度最高为98.5%,菌株T4与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为99.1%,菌株T5与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为99.6%,菌株T6与Pseudomonas putida KF703及菌株T5序列相似度最高为99.1%;由Clustal V法可知,菌株T3与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为97.0%,菌株T4与Pseudomonas plecoglossicida S21、Pseudomonas sp.N9-1及菌株T5序列相似度最高为97.7%,菌株T5与Pseudomonas plecoglossicida S21序列相似度最高为98.9%,菌株T6与菌株T5序列相似度最高为97.2%;由Clustal W法可知,菌株T3与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高均为97.7%,菌株T4与Pseudomonas plecoglossicida S21序列相似度最高为99.3%,菌株T5与Pseudomonas plecoglossicidaS21序列相似度最高为99.6%,菌株T6与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为97.9%。4种方法构建的系统发育树基本一致,可初步确立4株菌株的分类地位:菌株T3与Pseudomonas sp.G53亲缘关系最近,菌株T4与序列Pseudomonas sp.N9-1以及Pseudomonas sp.WP6亲缘关系最近,菌株T5与Pseudomonas sp.3-3(2010)亲缘关系最近,菌株T6与Pseudomonas plecoglossicida S21亲缘关系最近。     

产低温脂肪酶假单胞菌的选育及产酶条件的优化

从取自华中农业大学的土样和长江流域及桂林桃花江水样中筛选到一株产低温脂肪酶的适冷菌,初步鉴定为假单胞菌,命名为Pseudomonas sp.YT34-8.对其产酶条件进行优化,得到其最佳发酵条件为:玉米浆2.00%,豆饼粉2.50%,蔗糖1.00%,橄榄油0.57%,MgSO4·7H2O0.05%,K2HPO4 0.10%,发酵温度8℃,初始pH值7.0,发酵时间48 h,250 mL摇瓶装液量21 mL;摇瓶转速182 r·min-1.在此条件下,其发酵酶活力可达到7.833 U·mL-1.对其所产低温脂肪酶进行初步研究,其最适作用pH值为8.0,最适作用温度为30℃,在pH值5.0～10.0范围内、40℃以下酶活力较稳定.     

荧光假单胞菌FL10的筛选及发酵条件优化

从海水对虾养殖池水中筛选到一株对部分水产养殖病原菌有较强拮抗作用的荧光假单胞菌FL10,并对其发酵条件进行了优化。结果显示FL10的最佳发酵条件为:KB培养基(蛋白胨20g,MgSO4.7H2O 1.5g,K2HPO41.5g,甘油10mL,水1 000mL),发酵温度30℃,发酵起始pH值为7,发酵时间为36h,接种量5%,250mL的三角瓶装量为100mL。     

铜绿假单胞菌S8脂肪酶酶学性质及固定化研究

以耐甲醇铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)S8为出发菌株,通过摇瓶发酵产脂肪酶,对发酵脂肪酶粗酶液进行酶学性质及固定化研究。结果表明:该脂肪酶反应的最适温度为35℃,最适p H值为7.0,在p H 6.0~8.0酶活较稳定。以硅藻土为载体,采用吸附法,对脂肪酶进行固定,脂肪酶的最佳固定化条件为:载体硅藻土与脂肪酶质量比为10,固定化温度为30℃,缓冲液p H值为7.5,固定化时间为2.5 h。     

脂肪酶产生菌的分离、鉴定及其发酵条件优化

从被废油长期污染的土壤中分离出一株酶活力大于5 U/mL的菌株,经16S rRNA鉴定,确定为铜绿假单胞菌属,命名为Pseudomonas aeruginosa B6。经发酵优化,取得其最佳发酵培养基与条件:葡萄糖0.4%、酵母粉0.7%、硫酸铵0.7%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%;接种量为9.5%;起始pH值为6.5;温度为30℃,为脂肪酶发酵生产奠定了基础。     

草鱼铜绿假单胞菌灭活疫苗发酵条件的优化

为优化铜绿假单胞菌JP802灭活疫苗菌液发酵及灭活条件。通过单因素试验对铜绿假单胞菌JP802摇瓶培养温度、pH、接种量、转速4因素进行了优化筛选,采用正交试验法对发酵条件的参数进行了优化,并进行了验证试验及5 L发酵罐生长曲线;同时对铜绿假单胞菌JP802灭活疫苗发酵菌液灭活条件进行优化。试验结果表明,铜绿假单胞菌JP802株最适发酵条件为28℃,pH7.5,以10%接种量,转速270 r/min,通气量4 L/min,发酵培养12～14 h。灭活条件优化结果表明在灭活温度为37℃条件下,福尔马林终浓度在0.40%,灭活48 h即能完全灭活。通过对发酵条件的优化,可以获得更高产量的铜绿假单胞菌JP802发酵菌液。     

空间位置对聚丁二酸丁二醇酯固相反硝化脱氮性能的影响

采用室内装置以可生物降解聚合物(BDPs)聚丁二酸丁二醇酯[Poly (butylene succinate),PBS]为碳源和载体构建固相反硝化系统,研究反应器内上、中、下3层PBS颗粒表面所附着的生物量、质量损耗以及反硝化脱氮速率.结果表明,在进水硝酸盐浓度为50 mg/L、水力停留时间(HRT)为4h的条件下,反应器具有良好的脱氮能力,第20d时出水硝酸盐浓度降到0.2476 mg/L,去除率为99.50％.在生物量和质量损耗的试验中发现,PBS的空间物理结构对表面附着的生物量和PBS质量损耗有着显著的影响,随高度的增加呈递减趋势;上、中、下3层PBS表面所附着生物量分别为7.65×108、1.48×109、3.64×109 CFU/cm3,质量损耗量分别为0.3517、0.6749、3.9336 g.反硝化脱氮速率测试结果表明,上、中、下3层PBS颗粒的硝酸盐去除能力存在极显著差异,去除率分别为38.479％、72.128％和99.233％;在前9h内亚硝酸盐的含量都呈升高趋势,浓度分别为9.7075、7.2982、10.0527 mg/L,随后的14h内开始下降,终浓度分别为6.9351、5.3473、0.2119 mg/L;总氮的去除率分别为58.3449％、70.0623％和99.1570％.     

谷关假单胞菌脂肪酶基因PgLip1的克隆和表达

低温脂肪酶在饲料、洗涤、有机合成等行业中具有重要的应用价值，然而目前已发现的低温脂肪酶数量不多，对其基因多样性了解不够深入，因此有必要从自然环境中挖掘新的低温脂肪酶基因。为了获得低温脂肪酶基因资源，通过基因组序列比对分析，从谷关假单胞菌（Pseudomonas guguanensis）中发现并克隆获得一个脂肪酶基因P. guguanensis lipase 1 (PgLip1),并对该基因进行序列分析和蛋白质预测，表达后检测PgLip1的最适底物、最适pH、最适温度，同时研究了表面活性剂、变性剂、EDTA、金属离子及有机溶剂对该酶活性的影响。结果显示：该基因片段大小为840 bp，预测编码含279个氨基酸残基的蛋白质，氨基酸序列与来源于门多萨假单胞菌（Pseudomonas mendocina）的脂肪酶相似性92.6%。该酶的最适温度为10 ℃，在0 ℃相对酶活为60.2%，是一个低温脂肪酶；其最适pH为8.5，在pH 3.0~12.0时，仍然具有62%以上的相对酶活。40 ℃处理45 min后，PgLip1还能保持72.6%的残余酶活。该酶的最适反应底物为对硝基苯基丁酸酯(pNPB)；在高浓度异丙醇、异戊醇和乙酸乙酯中的酶活反而高于相应较低浓度中，吐温-20、吐温-80和Triton X-100表面活性剂能较大程度激活PgLip1（3.2~5.9倍）。研究丰富了对低温脂肪酶生物多样性的科学认识，所获得的PgLip1是一个受表面活性剂特异激活且对部分高浓度有机溶剂耐受的低温脂肪酶，具有较好的应用前景。     

产碱假单胞菌产精氨酸脱亚胺酶的发酵条件优化

对产碱假单胞菌产精氨酸脱亚胺酶的发酵条件进行了优化,结果表明,产碱假单胞菌产ADI的最佳发酵条件为:10 g·L-1蔗糖为碳源,6 g·L-1蛋白胨为氮源,10 g·L-1精氨酸诱导物,4%的接种量和30%的装液量,发酵温度29℃,发酵时间24 h,摇床转速为150 r·min-1,发酵液的初始p H8.5。在此条件下,产碱假单胞菌产ADI的酶活最高。     

施氏假单胞菌液态发酵降解茶皂素的条件优化

【目的】优化施氏假单胞菌液态发酵降解茶皂素的条件,以提高油茶籽粕在饲料方面的应用性能,增加经济效益和社会效益。【方法】以茶皂素降解率为评价指标,利用施氏假单胞菌液态发酵降解茶皂素,首先以培养时间、培养温度、培养基初始pH值、瓶口纱布层数、接种量为单一变量进行单因子试验,然后通过Plackett-burman实验、最陡爬坡试验、Box-Behnken设计响应面试验对施氏假单胞菌液态发酵条件进行优化。【结果】单因素试验获得的最佳单因素分别为:培养时间6d,培养温度25℃,培养基初始pH为8,瓶口纱布层数为6层,接种量为1%。在条件优化以后最佳的液态发酵条件为:培养时间5d,培养温度23℃,培养基初始pH为8,瓶口纱布层数为6层,接种量为1%,在此条件下,施氏假单胞菌液态发酵降解茶皂素的降解率达到66.92%。【结论】施氏假单胞菌微生物发酵法降解茶皂素具有成本低、重复性好、无二次污染等明显优势,在饲料方面具有一定的利用价值。     

铜绿假单胞菌脂肪酶基因(LipA)在枯草芽孢杆菌pab02中的整合表达

对铜绿假单胞菌脂肪酶基因(Lip A)进行克隆,构建整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,并在枯草芽孢杆菌pab02中整合表达。根据铜绿假单胞菌Lip A基因设计引物,扩增Lip A基因,并进行测序,构建整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,转化枯草芽孢杆菌pab02,并对转化后的阳性菌株进行诱导表达。结果显示,成功从铜绿假单胞菌A05菌株中扩增到长1 092 bp的Lip A基因,该基因与铜绿假单胞菌Lip A基因(登录号为AB290342)的同源性高达98%;该基因共编码311个氨基酸(aa),包含26个aa组成的信号肽和285个aa组成的成熟肽;成功构建了整合表达质粒pHSG398–16S–lip A,并将Lip A整合到枯草芽孢杆菌pab02染色体上,获得了重组枯草芽孢杆菌pab02–lip A;SDS–PAGE分析结果表明,脂肪酶蛋白得到了有效表达,该蛋白的相对分子质量约为37 000。     

施氏假单胞菌NRCB010的促生减排特性与全基因组序列分析

植物根际促生菌对促进作物生长及减排农田土壤N₂O具有重要作用。利用具有良好的促生及减排农田土壤氧化亚氮特性的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)NRCB010,通过试验分析其促生特性、反硝化能力及耐干旱胁迫性能,并采用三代Pacbio Sequl和二代Illumina Novaseq平台进行全基因组测序。NRCB010具有较强的硝酸盐还原能力,对于无机难溶磷酸钙和磷酸锌具有较好的利用效果,产生铁载体,耐受6%的盐浓度,在10%～20%的PEG6000浓度下较好生长;其基因组大小为4 570 338 bp,编码4 182个基因;含有反硝化代谢的相关基因及铁载体、细菌素等次级代谢产物的基因簇,并含有阳离子抗菌肽(CAMP)在内的多种环境适应相关基因。本研究初步揭示了NRCB010促进作物生长、减排农田土壤N₂O及其适应复杂环境能力的遗传学基础。     

沼泽红假单胞菌的培养优化及植物病害防治研究

沼泽红假单胞菌是应用较为广泛的一种光合细菌,在污水处理、农业种植、畜牧与水产养殖等领域都有较多应用。在自然培养条件下优化培养基配方,对培养条件中对影响细菌生长的因素进行探究。最终确定最佳C源乙酸钠添加浓度为10 g/L,最优N、P源为复合肥2(N:P:K=15:15:15),最佳添加浓度为0.5 g/L。细菌适宜生长的培养条件为温度25℃以上、光照强度4 000 lx以上、p H值范围为7.5～8.0。在植物病害防治实验中,结果表明：沼泽红假单胞菌对枣锈病病原菌、根腐病病原菌、褐腐病病原菌、叶霉病病原菌具有显著的抑制效果。     

红假单胞菌利用畜禽粪便产氢能力的试验研究

研究了红假单胞菌(Rhodobactersphaeroides)1 1737菌株利用猪粪产氢的能力及对猪粪的处理效果.结果表明,红假单胞菌能很好地利用猪粪生长并具有很高的产氢活性,猪粪污水COD为5687,3500,1214mg·L-1时的体积产氢率分别为23 7,18 5,15.0mL·L-1·d-1,产氢结束后COD值分别降至3586,2135,723mg·L-1.