Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中公布的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和实验室分离到的Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ株、Ⅰ型鸭病毒性肝炎R株所测序列（GenBank登录号分别为EU841005和EF585200）以及新型鸭肝炎病毒全基因组序列,应用PrimerPrimier5．0软件,在序列保守区域分别设计了2对鉴别引物,成功建立了Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的鉴别RT—PCR检测方法。结果表明：该方法能从Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒中扩增到与预期相符的471bp条带,从广东佛山分离到的新型鸭肝炎病毒FS株中扩增到705bp的条带,设计的2对引物能够特异性地检测出Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒,特异性好;分别能够检测出模板含量为0．8ng／μL和1．0ng／μL的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒。因此,该方法可用于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭病毒性肝炎临床样品的鉴别诊断和分子流行病学调查。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒概述

鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭的一种高度致死性、高度传播性的传染病.DHV分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,3个型之间无交叉保护作用.Ⅰ型DHV呈世界性分布,并常和其他病毒、细菌混合感染,对养鸭业危害严重,造成了巨大的经济损失.论文从Ⅰ型鸭肝炎病毒的病原特点、分类地位、分离培养、基因组结构和功能以及病毒的诊断与防控等方面,介绍了DHV-Ⅰ的研究概况.     

携带Ⅰ型鸭肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒的构建

为构建含有Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因的重组鸭瘟病毒,本研究将已建立的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBlueSK-TK-EGFP)进行改造,在其荧光表达盒内插入Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒3D基因,将重组后的转移载体(pBlueSK-TK-EGFP-30)转染已感染鸭瘟病毒的鸭胚成纤维细胞,转染细胞盲传2代后仍能观察到绿色荧...     

Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离与鉴定

鸭病毒性肝炎(duck virus hepatitis,DVH)是造成养鸭业严重经济损失的传染病之一。作者对松原市某鸭场送检的病死鸭进行病毒分离试验、雏鸭回归试验、DHV分离株ELD₅₀测定、雏鸭保护试验、鸡胚中和试验、鸭胚接种试验和电镜观察等,确诊该病为Ⅰ型鸭病毒性肝炎。试验所分离得到的Ⅰ型鸭肝炎病毒与标准毒株的回归试验病理特征存在一定差异,其基因序列的测定及分析还有待于进一步研究。     

A型鸭肝炎病毒微基因组的构建

为研究A型鸭肝炎病毒(DHAV)非编码区的结构和功能,笔者拟构建该病毒的微基因组并对其进行初步鉴定。采用酶切的方法将萤火虫荧光素酶报告基因(fLuc)与A型鸭肝炎病毒的ORF进行替换;并在5′UTR上游插入海肾荧光素酶报告基因Rluc作为内参基因;同时还在Rluc上游引入锤头状核酶,3′UTR下游引入丁型肝炎核酶,至此得到了含有双报告基因的A型鸭肝炎病毒微基因组(pRluc-fLuc)。将pRluc-fLuc转染DF-1细胞,8h便可以检测到报告基因的表达,24h表达量达到峰值。上述结果表明,已经成功构建了A型鸭肝炎病毒微基因组,这为进一步研究病毒非编码区的结构和功能以及病毒的翻译或复制的调控机理提供了良好的技术平台。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV—Ⅰ）A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-I快速检测的逆转录套式PCR方法（RT-nested-PCR）,采用该方法对DHV-Ⅰ A66弱毒株和R85952强毒株进行了检测。结果显示,均能扩增到304bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒（H9亚型）、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100Pg,第2次扩增的敏感性是1fg,第2次比第1次扩增的敏感性高10^6倍。表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎（DVH）的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法建立及初步应用

根据GenBank中鸭Ⅰ型肝炎病毒的基因序列,设计合成一对引物和一条Taq-Man探针。进行优化后,建立了能够检测鸭Ⅰ型肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,检测敏感性达到20个模板拷贝数,比常规PCR灵敏度高100倍;该方法特异性强,对番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鹅细小病毒等6种病原体的检测全为阴性。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,结果阳性率为1.69%。结果提示:在广西地区的鸭群中,存在鸭Ⅰ型肝炎病毒的感染,建立的荧光定量RT-PCR方法可用于鸭Ⅰ型肝炎病毒的临床快速检测。     

基因C型鸭甲型肝炎病毒分子生物学研究进展

鸭甲型病毒性肝炎是雏鸭的一种具有高度传染性的疾病,以急性发病、高病死率为特征。近年来,由基因C型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-C)引起的鸭甲型病毒性肝炎广泛流行于中国和韩国,严重影响养鸭业的发展。论文对DHAV-C的发现、分类地位、基因组结构及遗传进化等方面进行综述。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒二重荧光定量RT-PCR方法的建立

根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的基因序列,设计2对特异性引物和2条用不同荧光基团标记的TaqMan探针.对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法.该方法敏感性好,对鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的检测敏感性均达到200个模板拷贝数;该方法特异性强,对鸭圆环病毒、鹅细小病毒、鸭副黏病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性.本研究建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒的二重荧光定量RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床上鸭Ⅰ型肝炎病毒和番鸭细小病毒感染的检测.     

鸭病毒性肝炎的免疫学诊断进展

鸭病毒性肝炎（Duck virus hepatitis）是由鸭肝炎病毒引起的雏鸭的一种高度致死、传播迅速、以肝炎为主要特征的病毒性疾病。鸭病毒性肝炎分为各自独立的没有血清学关系的Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。1965年英国诺福克已接种了Ⅰ型鸭病毒性肝炎弱毒疫苗的雏鸭发生鸭肝炎，从病鸭中分离到的病原经交叉免疫试验证明与Ⅰ型鸭病毒性肝炎不同，故命名为Ⅱ型鸭病毒性肝炎。20世纪60年代后期Ⅱ型鸭肝炎在商品鸭群中消失，但至80年代英国的诺相克再度发生该病。     

一株经鸭胚传递的鸭副黏病毒的分离鉴定及生物学特性

从表现疑似副黏病毒症状的1日龄雏鸭和死亡鸭胚中分离到1株病毒,经HA、HI和病毒中和反应鉴定为副黏病毒,命名为SDFCH株。按常规方法测得SDFCH株的生物学毒力指标MDT、ICPI和IVPI分别为56.6 h、1.78和2.59,鸭胚半数致死量LD50为10-8.5,表明SDFCH株为副黏病毒强毒株。用分离病毒对11日龄鸭胚和7日龄雏鸭攻毒,孵化出的雏鸭和攻毒的雏鸭均出现明显的剖检变化。根据GenBank中NDV F基因序列设计合成了3对引物,通过RT-PCR扩增出了鸭源Ⅰ型禽副黏病毒(APMV-1)SDFCH株的F基因。与已发表副黏病毒F基因相关序列对比结果表明:SDFCH株与鸭、鹅源副黏病毒的同源性较高,核苷酸和氨基酸的同源性均在96.4%~98.0%之间,而与Lasota株同源性较低,核苷酸和氨基酸同源性仅为84.4%和87.9%。表明该毒株相对于传统的Lasota株已经发生了较大的变异。     

应用RT—PCR方法检测鸭病毒性肝炎新型和I型病毒

鸭病毒性肝炎病毒是危害养鸭业的重要病毒性传染病,主要感染低日龄雏鸭,临床上分离到的病原主要为鸭病毒性肝炎I型病毒和鸭病毒性肝炎新型病毒,为了加快本病的检测速度,尽快确诊病原,根据GeneBank上两种毒株的基因组序列,选择两种毒株的差异基因序列分别设计了一对特异性的检测引物,将两对引物放在一个PCR反应体系中,两种毒株分别进行特异性扩增,根据扩增片段的大小进行鉴别,建立了可以同时检测鸭病毒性肝炎病毒I型和新型毒株的复合RT—PCR方法,该检测方法快速,特异性强,灵敏性高,可以用于鸭病毒性肝炎病毒的分型鉴别检测。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)的基因序列,应用Oligo软件对DHV-1的保守基因3AB设计引物,以江西分离株(JXau-F)的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到预期大小的目的基因。通过对该方法的敏感性和特异性的检测,结果表明,建立的利用RT-PCR检测DHV-1的方法具有良好的敏感性和特异性。该法最低模板检测量为20 pg,且只能检测出DHV-1,对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸭瘟病毒、鹅细小病毒和健康的鸭肝组织均不能检出。克隆、测序证实了扩增基因的正确性。通过对临床病料检测结果表明,该方法可用于Ⅰ型鸭肝炎病毒的快速鉴别诊断。     

鸭圆环病毒病研究进展

近年来，鸭圆环病毒引起的鸭圆环病毒病对我国养鸭业危害严重。本文主要从病原学特征、基因组结构、致病机制、流行病学、临床症状、病理特征、诊断以及综合防治措施方面对鸭圆环病毒病进行了综述，以期为鸭圆环病毒病的研究方向和科学防治提供参考和借鉴。     

鸭病毒性肝炎的鉴别与防治

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒引起雏鸭的一种病死率高的急性、接触性传染病。本病有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个血清型。这三个型病毒在血清学上有明显差异，无交叉免疫性。Ⅰ型鸭肝炎病毒又称古典株，我国流行的鸭病毒性肝炎病毒多属此型。[第一段]     

鸭“白点病”（暂定名）病原学研究

对3个“白点病”（暂定名）发病严重的鸭场的病死鸭进行细菌学检查均为阴性，但均分离到病毒。对其中1株病毒进行了鉴定。负染及超薄切征电镜观察，可见呈球形或卵圆形、直径80-230nm、有囊膜的病毒。经理化特性、生物学特性及核酸类型测定，确定该病毒为疱疹病毒科成员。血清中和试验表明，该病毒与鸭瘟病毒、鸭疱疹病毒Ⅱ型无血清学相关性，故暂定名为鸭疱疹病毒Ⅲ型。人工感染试验复制出与自然感染病死鸭相同的病变，初步证明该病毒为鸭“白点病”病原。     

山东地区Ⅰ型鸭肝炎病毒分离鉴定及单克隆抗体的研制

用SPF鸡胚从临床上疑似鸭病毒性肝炎(DVH)的商品肉仔鸭肝脏中分离得到一株病毒。该病毒能在96h内致死鸡胚,48h内致死鸭胚,死胚尿囊液无血凝性。RT-PCR和血清中和试验的结果表明,该病毒为Ⅰ型DHV。用该病毒免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以浓缩提纯后的该病毒为筛选抗原,通过间接ELISA法对杂交瘤进行筛选,经亚克隆后获得一株针对Ⅰ型DHV的特异性单克隆抗体,并对该株单克隆抗体的特性进行了鉴定。     

应用RT-PCR检测鸭肝炎病毒Ⅰ型感染

鸭肝炎病毒Ⅰ型(duck hepatitis virus Ⅰ,DHV Ⅰ)感染是雏鸭的一种急性高度致死性传染病,主要侵害4周龄以内的雏鸭,特别是1周龄以下的雏鸭最易感染,死亡率较高,是危害养鸭业最为严重的传染病之一[1].1945年在美国首次发现,我国于1963年在上海首次报道了该病的临床病例,至今,全国各养鸭地区均有不同程度的发生和流行.目前,已有多种检测DHV Ⅰ抗原的方法,如免疫电镜、Dot-ELISA和病毒中和试验等,这些方法在DHV Ⅰ的诊断中各有优势.PCR作为一种新的分子生物学检测技术,具有灵敏度高、快速、特异、操作简单等优点[2～4].本实验通过目前已发表的DHV Ⅰ基因组序列相对保守的区域设计引物,成功建立了RT-PCR方法检测鸭肝炎病毒1型.     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据获得的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒（DHVⅠ）RNA聚合酶基因序列，应用Primer Premier5．0软件设计了1对引物，建立了检测DHVⅠ的RT-PCR方法。该法能从DHVⅠ中扩增到440bp的条带，而对正常鸭胚尿囊液、健康鸭肝、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、雏鹅新型病毒性肠炎病毒、禽流感病毒（H5N2亚型）、鸭病毒性肿头出血症病毒、鸭源多杀性巴氏杆菌（5：A）的扩增结果均为阴性。该法最低可以检测到30pg的DHV工核酸模板。RT-PCR对DHVⅠ强毒CHv-1株人工感染发病死亡鸭肝的检测结果与病毒分离和Dot—ELISA检测结果的阳性检出率均为100％，对脾、肺、脑病料的检出率显著（P≤0．01）高于病毒分离和Dot-ELISA。RT-PCR、病毒分离和Dot—ELSA对1987～2005年采集且保存于-20℃的经病毒分离已确诊为鸭肝炎的临床送检肝病料的检出率分别为100％（19／19）、36．84％（7／19）和57．98％（11／19），对2000-2005年采集且于-20℃保存的来源于中国18个省份发病鸭群的48份肝病料的检出率分别为100％（48／48）、56．25％（27／48）和75．00％（36／48）。结果表明，建立的RT—PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于DHVⅠ的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

DVH-Ⅰ的研究进展

鸭病毒性肝炎是养鸭业常见的疾病,由于其理化特性决定了对不良环境的抵抗力很强,一直以来给养鸭业造成了极大地经济损失.本文着重对Ⅰ型鸭病毒性肝的理化性质,检测方法和诊断方法的研究情况进行报道.