猪Chemerin和受体基因的克隆与组织分布

基于电子延伸序列,本试验克隆并分析了猪Chemerin和受体(ChemerinR)基因;各种组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coli JM109,检测阳性克隆并测序;结果表明:猪Chemerin cDNA克隆片段为558 bp,开放阅读框架为492 bp,编码有163个氨基酸.ChemerinR cDNA克隆片段为1 470 bp.开放阅读框架为1 092 bp,编码363个氨基酸.同源分析结果表明,猪Chemerin的核酸序列与牛、人和大鼠的同源性分别为86.7%,79.1%和73%,氨基酸序列的同源性分别为83.1%、83.4%和67.7%,ChemerinR的核酸序列与人、大鼠和小鼠的同源性分别为80.4%、77.6%和72.6%,氨基酸序列的同源性分别为88.2%、80.7%和79.3%.组织分布结果显示:猪Chemerin在多种组织均有分布,ChemerinR仅在膀胱、大脑和肌肉有分布.     

猪Lipin基因克隆及其组织分布的研究

采用逆转录PCR、电泳检测等方法,成功克隆得到了猪的Lipin1、Lipin2和Lipin3基因。这3个基因与小鼠的相应基因均具有较高的同源性,达83．2％～86．7％。组织分布结果显示：Lipin1广泛分布在猪的多种组织中,但Lipin2和Lipin3仅在肌肉、肺、回肠和睥中有分布。     

猪Lipin基因克隆及其组织分布的研究

采用逆转录PCR、电泳检测等方法,成功克隆得到了猪的Lipin 1、Lipin 2和Lipin 3基因。这3个基因与小鼠的相应基因均具有较高的同源性,达83.2%⁸6.7%。组织分布结果显示:Lipin 1广泛分布在猪的多种组织中,但Lipin 2和Lipin 3仅在肌肉、肺、回肠和脾中有分布。     

贵州香猪IGF 1基因的克隆及组织分布

应用RT-PCR技术从香猪肝脏克隆到胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)基因,共612bp,包含完整的开放读码框,与已知猪种的核苷酸相似性为99%~100%,编码的153个氨基酸包括信号肽、前体肽、B、C、A、D、E区,成熟肽仅由B到D区组成(70aa).香猪IGF-1的氨基酸序列与长白猪完全一样,与淞辽黑猪相差一个氨基酸(E区);与人、犬、牛、马等的差异主要集中在信号肽、前体肽和E区,成熟肽完全相同;与小鼠的差异最大,成熟肽区有4个氨基酸不同,其他区域还有11个氨基酸不同.对香猪IGF-1成熟肽的三维结构分析结果显示,蛋白有3个α-螺旋,3对二硫键分别联系α-螺旋的N端和C端.对香猪IGF-1基因的组织分布研究结果显示,IGF-1基因在肝脏、脾、脂肪、软骨、肌肉、子宫组织中均有表达,其中肝脏的表达量最高;脊髓、肺中未检测到表达,提示IGF-1的旁分泌作用具有组织特异性.     

五指山小型猪生长激素释放激素受体基因的cDNA克隆及序列分析

[目的]克隆五指山小型猪生长激素释放激素（GHRH）受体基因的cDNA,并对其进行序列分析。[方法]以五指山小型猪耳组织提取的基因纽RNA为模板,根据已报道的猪GHRHRcDNA序列设计3对引物,用RT—PCR方法进行cDNA扩增。PCR产物经回收纯化后,与pMD18-T连接并转化大肠杆菌DH5a,转化产物经PCR和双酶切鉴定后筛选出阳性克隆,阳性克隆经LB液体培养基培养鉴定后测序。[结果]成功获得了五指山小型猪GHRH受体基因的cDNA,该片段长1577bp,编码423个氨基酸。BLAST分析结果表明,该片段与猪GHRH受体基因仅有23个碱基的差异,同源性为98％;而两者GHRH受体基因均由423个氨基酸组成,序列同源性为96％。[结论]该研究为进一步揭示五指山小型猪的矮小机理提供了理论依据。     

猪脂肪特异性蛋白27基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,克隆并分析了猪脂肪特异性蛋白27基因.各种组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coli JM109,检测阳性克隆并测序.猪FSP27基因的cDNA序列,其全长为745bp,开放阅读框为11-72Top,编码有238个氨基酸.同源分析结果表明,猪FSP27的核酸序列与人、小鼠和牛的同源性分别为86%、77.6%、82.3%.氨基酸序列的同源性分别为83.2%、74.4%、79.3%.组织分布结果显示:猪FSP27基因在多种组织均有分布.克隆的猪FSP27基因并注册GenBank(Accession.EU395789).     

猪Ob-Rb基因的克隆与分析

[目的]采用RT-PCR法克隆与分析瘦素受体06-Rb cDNA序列。[方法]从160日龄初情期的苏姜猪的下丘脑中提取组织总RNA．根据GenBank中猪06．RbmRNA全序列设计引物,用反转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）进行cDNA扩增,获得1条343bp的片段,将PCR产物克隆于pGEM—Teasy载体后进行测序分析。[结果]用紫外分光光度计检测所提取的RNA质量,0D260／OD280=1.9,证明所提RNA的质量较好,无降解和蛋白质污染;用1％的琼脂糖检测所提RNA,有3条清晰的条带,分别是28S、18S、5S,28S与18S浓度比约为2：1．说明所提的RNA的完整性较好。所获D6-RbcDNA序列用Blast程序与在GenBank中发表的猪06-Rb cDNA序列（AF092422）比较表明,其同源性为100％,说明所扩增的序列是正确的。[结论]该研究为进一步探索Ob-Rb基因组织表达和作用机理奠定了理论基础。     

神经介素B及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的差异表达

[目的]本试验旨在探究神经介素B(NMB)及其受体NMBR[还包括胃泌素释放肽受体(GRPR)和蛙皮素受体(BRS3)]在山羊不同发育阶段睾丸组织中的差异表达,为解析哺乳动物睾丸发育及功能调节机制提供参考。[方法]选取系谱清晰和体况良好的雄性山羊12只(3月龄和9月龄,各6只)进行阉割并采集睾丸组织,在克隆NMB及其受体基因与分析序列的基础上,采用免疫组化技术检测NMB及其受体在睾丸组织中的表达定位,利用RT-qPCR和Western blot检测NMB及其受体在不同发育阶段山羊睾丸组织中的表达变化。[结果]NMB及其受体基因与绵羊和牛的进化关系最近,NMB及其受体基因编码区的核苷酸序列与牛和绵羊的同源性达96%以上,结构分析发现NMBR、GRPR和BRS3均属于7次跨膜受体。NMB及其受体在3月龄和9月龄山羊睾丸组织中广泛表达,其中在间质细胞、肌样细胞和精子细胞中呈高表达。与3月龄山羊相比,9月龄山羊睾丸组织中NMB与GRPR的mRNA和蛋白表达量显著降低(P<0.05),而NMBR与BRS3的mRNA和蛋白表达量显著增加(P<0.05)。[结论]NMB及其受体可能参与山...     

猪Musclin基因片段克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析猪musclin基因;【方法】肌肉组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coliDH5α,检测阳性克隆并测序;【结果】克隆的猪musclin基因片段与人、大鼠、小鼠同源性分别为86%、78%、75%,预测的氨基酸序列含有“KKKR”结构和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域;【结论】克隆了猪musclin基因片段并注册GenBank(Ac-cession.EF369511)。     

猪IRGC基因的克隆与序列分析

[目的]对猪IRGC基因进行序列分析,为进一步研究其功能奠定基础。[方法]采用EST信息和测序相结合的方法分离了猪IR-GC基因,并与人、牛、犬和猩猩IRGC基因进行序列相似性分析。[结果]获得了1 558 bp的cDNA序列,其登录号为EU703776,与人、牛、犬和猩猩IRGC基因的序列分别有86%、90%、91%和84%的相似性。序列分析表明,该基因编码的464个氨基酸与人、牛、犬和猩猩的相似性分别达到了90%、93%、95%和90%。[结论]成功提取了猪IRGC基因,其具有人、牛、犬和猩猩类似的结构和功能。     

猪Cathepsin B基因和Cystatin B基因mRNA表达的发育性变化及组织差异

 【目的】研究猪肉嫩度性状候选基因-组织蛋白酶B（cathepsin B,CTSB）和半胱氨酸蛋白酶抑制素B（cystatin B,CSTB）在体内不同组织、不同发育阶段的表达变化规律,为研究嫩度性状的遗传调控机理提供依据。【方法】采用荧光探针RT-PCR,定量分析CTSB和CSTB mRNA在两个品种猪的多个组织、多个发育时间点的表达量。【结果】RT-PCR结果表明,CTSB和CSTB mRNA表达量最高的组织为肾脏,心肌和骨骼肌中表达丰度低,股四头肌CSTB mRNA表达量极显著高于背最长肌。CTSB mRNA表达量在0～5月龄长白猪和梅山猪背最长肌中表现出先升高后降低的变化趋势,梅山猪峰值出现较早,并在4月龄后再次出现急剧上升。CSTB mRNA表达量在梅山猪中表现出生初期较高,随后逐渐降低的表达模式,长白猪的表达模式则为出生后表达量急剧升高,2月龄达到峰值,随后逐渐降低。2品种猪背最长肌组织CTSB和CSTB mRNA表达量表现出显著正相关。【结论】CTSB和CSTB mRNA表达量受到组织、发育阶段和品种影响,2基因mRNA表达量呈显著正相关。     

猪生长激素cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达

用逆转录－聚合酰链式反应（RT－PCR）方法，从猪脑垂体总RNA中扩增出编码猪生长激素（GH）成熟及基因序列，定向克隆至质粒pUC18，序列分析表明，克隆的猪GH cDNA长573bp，不含信号肽序列，并在该序列之前加入一起始密码子ATG。将猪GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220，构建成重组GH基因表达载体pBVpGH7。SDS－PAGE和薄层扫描分析表明：经42℃诱导，pBVpGH7在大肠杆菌中可表达一分子量约2200的特异蛋白，表达量约占细胞总蛋白的20．5％。     

猪2型钙蛋白酶抑制蛋白基因cDNA的克隆序列分析

钙蛋白酶抑制蛋白（Calpastatin,CAST）是一种内源性的、需Ca2＋激活的钙蛋白酶抑制剂.本研究克隆了猪CAST基因的部分编码序列,并通过序列拼接首次获得了猪2型CAST基因的cDNA序列（Genbank acc.NO.AY555195）.通过对猪2型钙蛋白酶抑制蛋白进行结构预测及结构域分析,为进一步研究钙蛋白酶抑制蛋白在猪体内的功能打下了良好的基础.     

猪Mighty基因的克隆与组织表达分析

Mighty基因是在骨骼肌中发现的一个新颖的肌形成前期因子。基于电子延伸序列,本试验成功克隆出了Mighty基因,其全长874 bp,开放阅读框为579 bp,编码有193个氨基酸,提交GenBank(EU559709)。同时,试验采取半定量RT-PCR法,以18S rRNA为内标,研究了Mighty基因在仔猪18个组织中的分布和mRNA的表达水平。     

树鼩脂蛋白脂肪酶的cDNA克隆、组织分布及活性测定

目的了解不易感动脉粥样硬化动物树鼠句的脂蛋白脂肪酶的结构和活性特点,并与其它种属比较,探讨脂蛋白脂肪酶在树鼠句独特脂代谢中的作用。方法以树鼠句脂肪细胞mRNA反转录获得的cDNA一链为模板,应用SMART-RACE技术获得树鼠句脂蛋白脂肪酶的cDNA序列并推导出其氨基酸序列;实时定量PCR方法检测树鼠句脂蛋白脂肪酶mRNA在各组织中的分布;真核表达树鼠句和人脂蛋白脂肪酶蛋白,放射性同位素法测定二者的活性并比较。结果树鼠句脂蛋白脂肪酶cDNA序列全长为3293bp,其中编码区1437bp,编码20个氨基酸的信号肽和458个氨基酸的成熟蛋白,该成熟蛋白N-端比人脂蛋白脂肪酶多10个氨基酸。树鼠句脂蛋白脂肪酶与其它哺乳类动物的氨基酸序列同源性大于90%,功能域高度保守。树鼠句脂蛋白脂肪酶的组织表达谱比较广泛,在心肌和脂肪组织中大量表达,但在骨骼肌中未检测到,却在肝脏中有中低水平表达,与人脂蛋白脂肪酶在这两种组织中的表达相反。活性测定结果显示,树鼠句脂蛋白脂肪酶活性显著高于人(7.67倍),这与测定的树鼠句血浆低甘油三酯水平相符。结论树鼠句的高活性脂蛋白脂肪酶可能是其血浆低水平甘油三酯的主要原因。     

草鱼转铁蛋白受体cDNA序列克隆及其组织表达差异

根据斑马鱼血清转铁蛋白受体(TfR)序列(NM_001009918)设计并合成一对引物,提取草鱼肝脏组织总RNA,RT-PCR扩增获得草鱼TfR cDNA部分序列873bp,获得GenBank登陆号为FJ613322.将测序结果用DNAman软件与斑马鱼的序列进行比对,发现核苷酸同源性为84%,氨基酸同源性为81%.利用半定量RT-PCR技术检测TfR草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、黏液、性腺、鳔、肝脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12种组织的表达差异结果表明,TfR在草鱼12种组织中均可表达,其中在脑与鳍中表达量最高,但与在心脏、性腺中的表达量无显著差异(P0.05),在黏液与鳔中表达量最低,二者之间无显著差异(P0.05).     

兔神经肽W及其受体NPWR1基因克隆及分布定位

【目的】研究神经肽W（NPW）及其受体1（NPWR1,GPR7）mRNA 在兔各器官组织的表达情况。【方法】利用基因克隆方法克隆出兔神经肽W及其受体的cDNA序列片段,以GAPDH 为内参基因,采用相对定量RT-PCR 方法检测NPW及NPWR1 mRNA 在兔体内各组织中的表达情况,用原位杂交方法研究NPWR1阳性细胞在兔脑的分布定位。【结果】克隆出兔NPW及其受体NPWR1的基因部分序列,NPW基因片段长234 bp,NPWR1基因片段长508 bp,GenBank 登录号分别为HQ596517和HQ596518;经DNAStar软件分析,不同物种之间NPW及其受体基因序列的同源性较高。NPW及其受体在兔各组织广泛分布;NPWR1 mRNA在脑内主要分布于海马、小脑、下丘脑、延髓等部位。【结论】兔NPW及其受体基因在进化上是保守的;NPW及其受体在兔体内广泛表达,提示其参与多种生理功能的调节。     

梅花鹿IGF1全长cDNA克隆及在鹿茸组织的表达

为了检测梅花鹿鹿茸组织IGF1基因的mRNA表达水平,利用TRIzol试剂法分别提取鹿茸真皮、间充质、前软骨和软骨组织总RNA,逆转录合成cDNA.根据GenBank已发表的相关序列设计梅花鹿IGFI基因特异引物并克隆IGFI基因,将IGF1基因DNA序列递交GenBank,并利用相对荧光定量Real-time PCR...