猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

经非猪瘟免疫猪增殖猪瘟病毒石门株,从抗凝血中直接提取病毒RNA进行RT-PCR,获得了猪瘟病毒石门株E2基因片段。克隆后测序,结果表明石门株的E2囊膜糖蛋白与国外报道的5株猪瘟病毒的E2囊膜糖蛋白具有相同的骨架结构,即均具有15个半胱氨酸残基和5个潜在糖基化位点,此外石门株也具有保守序列RYLASLH。同源性比较表明,石门株与日本的ALD株和GPE#+-株同源性最高,而与欧洲的Alfort株同源性最低。与国内的疫苗种毒（482代）、疫苗毒以及国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株同源性比较表明,石门株与种毒(482代)同源性最高,其次为国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株,而与国内使用的疫苗毒同源性最低。本研究提示国内疫苗毒的E2基因在生产中有较大变异,可能导致抗原漂移。     

猪瘟病毒贵州株E2基因序列的分析

为研究猪瘟病毒贵州株变异情况及分子进化情况,对CSFV E2部分基因进行了扩增,应用分子克隆技术,将目的基因与pMD-18T克隆载体进行连接,转化至感受态大肠杆菌DH5α,经PCR与酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定,采用生物信息学软件对E2基因序列进行序列分析.结果,从疑似临床病料中扩增出与预期大小(508 bp)...     

猪瘟病毒石门株动物传代脾毒与组织培养细胞毒E2基因序列的分析

根据已发表的猪瘟病毒基因组序列,设计合成了2对引物,以脾毒和细胞毒总RNA为模板,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、套式聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术,对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒主要囊膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定,用DNAstar软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现,脾毒和标准石门株核苷酸序列的同源性为99.4%,氨基酸序列的同源性为99.0%;细胞毒与标准石门株核苷酸序列的同源性为98.3%,氨基酸序列的同源性为96.7%。由此说明,猪瘟病毒经猪体多次传代和组织培养致细胞病变后,均能保持遗传的稳定性。     

猪瘟病毒石门株E2基因4个抗原结构域的原核表达

【目的】对猪瘟病毒石门株E2基因进行原核表达，以期获得可溶性表达产物，为检测猪瘟抗体的ELISA试剂盒的研制奠定基础。【方法】用PCR技术扩增了重组S21质粒载体上的猪瘟病毒石门株E2基因的4个主要抗原结构域ABCD，A1A2，B和C。分别将4个片段克隆于pMAL－p2X载体中，经PCR、双酶切和测序鉴定，E2基因的4个主要抗原结构域片段的位置、大小和读码框均正确。将4个片段分别转化到表达菌TB1、BL21、BL21－CodonPlus(DE3)-RP和BL21(DE3)中，共得到16株重组表达菌，用IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析。【结果】E2基因的4个主要抗原结构域均可在这4种表达菌中表达，但以BL21－CodonPlus(DE3)-RP的表达效果最好，可表达出可溶性并且产量较高的目的蛋白。免疫印迹结果表明，表达的目的蛋白可以被猪瘟阳性血清和针对E2蛋白的单克隆抗体所识别。【结论】只表达目的基因的抗原结构域，可以缩短表达片段的长度，有利于获得可溶性目的蛋白，并且具有良好的血清学反应的特异性。     

猪瘟病毒新疆南疆野毒株E2基因序列分析及致病性研究

应用RT-PCR技术对新疆南疆两地的猪瘟阳性病料进行了扩增 ,并对扩增的产物进行了核苷酸序列测定.结果扩增的两株野毒的E2基因序列相同 ,与已知的中国C株E2基因相应序列比较,其同源性为82.8;,推导的氨基酸同源性为88.3;.用这两株野毒人工感染健康易感仔猪,观察其致病性,结果两株野毒引起的临床症状及剖检变化相似,均呈现比较典型的猪瘟病变.免疫酶组化显示,猪瘟病毒主要攻击脾脏、淋巴结等免疫器官,其次为肾脏、脑等器官.结果表明,NJKS、NJAKS两株野毒为中等毒力或偏强,能引起亚急性型猪瘟.     

猪瘟病毒E2基因研究进展

猪瘟E2基因是常用的分析猪瘟基因类型和遗传变异的重要基因,其编码产生E2蛋白,是诱导机体产生中和抗体的重要蛋白,对机体的免疫应答产生重要的影响。通过收集、整理相关资料,分析阐述当前对猪瘟病毒E2基因的研究进展,以期为我国开展猪瘟病的防控工作提供参考。     

猪瘟病毒石门株NS4B基因的序列测定及分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,利用２对引物,从猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）强毒石门株感染的猪血中成功扩增了ＮＳ４Ｂ基因,片段大小分别为７５７ｂｐ和７７４ｂｐ。克隆后经酶切鉴定,自动测序和序列分析,结果显示该基因较为保守,与其他猪瘟病毒毒株均有很高的同源性,与同属的ＢＶＤＶＳＤ－１株和ＮＡＤＬ株也有较高的同源性。     

广西猪瘟病毒E2基因克隆及序列分析

[目的]了解广西猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的变异规律及其与疫苗株的基因差异,为正确选择猪瘟疫苗和防制广西猪瘟提供参考依据.[方法]以广西本地的阳性猪瘟病料为研究对象,应用RT-PCR扩增CSFV的E2基因,经克隆、测序后用DNASTAR软件对其序列进行比对分析,并绘制遗传进化树.[结果]从41份疑似猪瘟病料中共扩增出4个阳性样品的E2基因(1140 bp),经序列比对分析发现,扩增获得的4株CSFV毒株(GXGG1、GXLC1、GXLC2和GXNN1)与兔化弱毒株(HCLV)、Shimen强毒株的核苷酸同源性为82.1%~82.3%和82.9%~83.4%、其推导氨基酸同源性为88.4%~89.2%和88.9%~90.0%,4株毒株间的E2基因核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为90.8%~99.6%和94.2%~99.5%,且均属于基因群Ⅱ;E2基因推导的氨基酸表明,E2蛋白空间结构及抗原结构的氨基酸位点693Cys、737Cys、792Cys、818Cys、828Cys、856Cys、833Pro、834Thr、837Arg均未发生变异,但其单抗识别位点G713E、N729D、K734R发生变异.[结论]近年来广西CSFV流行毒株的变异未出现较大差异.与HCLV株、Shimen强毒株亲缘关系较远,但与Paderborn株、GXWZ02株亲缘关系较近.     

猪瘟病毒C株E2基因克隆及重组pGAPZα的构建

从猪瘟弱毒活疫苗中提取猪瘟病毒(CSFV)RNA,采用RT-PCR技术,得到E2基因的cDNA,连接到pMD-18T载体上进行测序。将E2基因的cDNA及质粒pGAPZαA分别以内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行顺序酶切,连接酶切产物并转化Escherichia coliDH5α。经过抗生素Zeocin筛选、PCR鉴定和重组质粒的酶切分析,将E2基因的测定序列与GenBank中的CSFV C株E2基因序列(序列号Z46258)比对,核苷酸同源性为99.46%;获得6个阳性重组子的克隆株。结果表明,重组质粒pGAPZα-E2中目的基因E2的核苷酸序列和大小、插入方向和位置是正确的。     

猪圆环病毒2型广东分离株的基因序列分析

【目的】本文研究了广东猪圆环病毒2型(PCV2)基因的遗传变异。【方法】采集来自不同猪场疑似PMWS的组织样品15份,用PK-15细胞增殖病毒,并进行间接免疫荧光试验鉴定,采用PCR方法扩增PCV2全基因组序列,分析其核苷酸和氨基酸序列的变异情况。【结果】GD-1和GD-2属于PCV2d亚型,其基因组由1767个核苷酸组成;GD-3,GD-4和GD-5属于PCV2a亚型,基因组由1768个核苷酸组成。5个分离株的核苷酸序列同源性为95.0%~99.9%;PCV2分离株ORF1的核苷酸和氨基酸序列高度保守,其同源性分别为96.8%~100%和99.4%~100%;GD-1和GD-2由702个核苷酸组成,编码233个氨基酸,GD-3、GD-4和GD-5由705个核苷酸组成编码234个氨基酸,5个分离株ORF2的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.9%~99.9%和88.0%~100%。【结论】广东省确实存在PCV2,但可能存在由PCV2b到PCV2d的变异。因此,有必要进一步研究PCV2基因变异对其致病性与Cap蛋白抗原性的影响,为培育和筛选更为有效的疫苗株奠定基础。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2研究进展

猪瘟(classical swine fever,CSF)是危害养猪业的主要传染病之一,致病原是猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV),E2囊膜糖蛋白是CSFV的主要抗原蛋白.本文对E2蛋白的分子结构、抗原特性、对病毒毒力的影响和在进入靶细胞过程中的作用等4个方面的研究现状进行了阐述.     

猪瘟病毒E2基因的克隆表达

PCR扩增猪瘟病毒(CSFV)定点突变后的E2基因,克隆至原核表达载体质粒pET-28a中,重组质粒pET28a-E2转化BL21(DE3),IPTG诱导,高效表达了E2基因,表达量达菌体总蛋白的25.3%。免疫印迹表明,所表达的蛋白是CSFV特异性的。     

猪瘟病毒石门株NS3基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,扩增了猪瘟病毒石门株NS3基因的丝氨酸蛋白酶、NTPase、RNA解螺旋酶活性功能区长度为2 000 bp的片段,将其克隆到pET-32a中,构建了原核表达载体pET-NS3,并将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,同时对表达产物进行了SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,IPTG诱导表达得到的pET-NS3融合蛋白的相对分子质量约为97 ku,与预期结果一致,且该重组蛋白能被CSFV阳性血清所识别。     

猪园环病毒2型江西株的全基因序列分析

根据已发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)的全基因组序列,设计1对特异性引物,进行PCR扩增,将1个扩增产物连接到pUCm-T vector上并克隆到大肠杆菌DH5α中,得到1个阳性克隆,经提取质粒进行PCR、酶切、测序鉴定,证明扩增出了PCV-2目的片段.结果表明本实验分离株(JXPCV-2)与国内外不同地域的PCV-2全基因组序列的差异很小,同源性在94.2%～99.7%;进化树分析表明JXPCV-2与其他10株PCV-2分离株的亲缘关系较近,与浙江分离株(AY691169)亲缘关系最近.     

猪瘟病毒石门株NS5A基因的序列测定及同源比较

根据已发表的猪瘟病毒序列,设计并合成了３对引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从猪瘟病毒石门株感染猪血中成功扩增了各ｃＤＮＡ片段,覆盖整个ＮＳ５Ａ基因,片段大小各为７７４,６８５,９１７ｂｐ。克隆后测序。序列比较结果显示,该基因在ＣＳＦＶ中较为保守。与同属的ＢＶＤＶ的序列同源性较低,且氨基酸的同源性低于核苷酸的同源性。推测它参与决定瘟病毒的特异性。     

猪瘟病毒E2基因的哺乳动物细胞表达

利用PCR技术扩增出猪瘟病毒主要结构蛋白E2基因的全序列,将其克隆到真核表达载体PEGPF-C1中,获得重组质粒PEGPF-E2,经PCR,酶切鉴定和序列分析证明目的基因的大小、插入位置和读码框完全正确。利用脂质体将阳性质粒PEGFP-E2转染入猪肾来源的细胞PK-15中,G418筛选出阳性的细胞克隆,通过PCR证明E2基因存在于筛选出的阳性细胞克隆中。利用荧光倒置显微观察阳性细胞发现有融合蛋白的表达,利用夹心ELISA猪瘟病毒抗原检测试剂盒检测证明表达的融合蛋白为猪瘟病毒E2基因编码蛋白。     

猪圆环病毒2型厦门株-1的ORF2基因序列分析

根据猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,设计合成1对引物,对PCV2厦门株-1(XM-1)的ORF2基因进行PCR扩增.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,可清晰看见1条与设计相符的大小为729 bp的特异条带.提取该片段进行测序,并与国内外24株PCV2毒株的ORF2进行比较,发现得到的PCV2 XM-1的ORF2与广西PCV2分离株(AY556475)核苷酸和氨基酸序列同源性均达到100%,与其它PCV2毒株ORF2的同源性分别为91.6%-99.9%和88.9%-100%,表明厦门地区生猪已感染PCV2,PCV2的ORF2基因与其它毒株有所不同.     

鸭病毒性肝炎病毒NA株全基因序列测定及分析

应用RT-PCR方法分段扩增DHV-NA株cDNA,并进行基因组全序列测定及同源性等分析。结果显示DHV-NA株基因组全长7 692 bp(不包括PolyA),5'和3'非编码区长度分别为626 bp和316 bp,有1个单一开放阅读框架(ORF,627~7 376 nt),编码2 249个氨基酸;与I型DHV(DHV-Ⅰ)参考株比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.3%~96.9%和97.8%~98.8%;与新型DHV(N-DHV)90D株比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为72.6%和82.3%。表明NA株与DHV-Ⅰ参考株遗传进化关系较密切,而与N-DHV遗传关系较远。     

斗鸡新城疫病毒DQ株融合蛋白基因序列分析

从越南斗鸡暴发的病例中分离出1株新城疫病毒（NDV）,命名为贵州分离株（DQ）。采用RT—PCR方法扩增分离株（DQ）的整个F基因片段,并将其克隆到pMD-18T载体中。序列分析结果表明,DQ株F基因分子长为1662bp,编码553个氨基酸。该毒株与国内2株分离株（CH2000、TW2000）之间的亲缘关系较近,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95．7％-96．6％和96．6％-96．8％;但与LaSota、B1及1748E9等常见毒株的核苷酸和氨基酸同源性仅为84．0％-86．5％和87．2％-89．9％。DQ分离株在F蛋白裂解住点的氨基酸顺序为^112R—R—Q—K—R—F^117,与NDV强毒株特征相符,且具有101处的K（赖氨酸）和121处V（缬氨酸）2个特征性氨基酸,与NDV基因Ⅶ型的特性完全相符。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树表明该分离株为基因Ⅶd亚型。     

猪瘟病毒E2蛋白在大肠杆菌中的表达及其可溶性分析

旨在表达出囊膜糖蛋白E2,为猪瘟病毒的亚单位标记疫苗研制、血清学诊断等提供依据。以pMD-18T-E2为模板,扩增猪瘟病毒E2基因,克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pET-28a-E2,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中诱导表达。结果显示,通过SDS-PAGE凝胶电泳可检测到46ku的蛋白条带,与预期结果一致;目的蛋白主要以包涵体形式存在。将E2蛋白变性纯化后,分别采用透析复性和稀释复性2种方法进行复性,成功得到可溶性E2蛋白。