神索葡萄自然发酵酵母菌群研究

利用WL营养琼脂培养基,对宁夏御马葡萄酒厂的神索葡萄自然发酵过程中不同阶段分离得到的105株葡萄酒相关酵母进行初步鉴定和聚类,进而对代表性菌株进行26S rDNA D1/D2区的序列分析。结果表明:供试酵母菌株经分类鉴定应归入4属5种,分别是葡萄汁有孢汉逊酵母Hanseniaspora uvarum、毕赤克鲁维酵母Pichia kluyveri、假丝酵母Candida zemplinin、酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae和巴氏酵母Saccharo-myces pastorianus,分别占分离菌株总数的3%、8%、1%、1%和87%;非酿酒酵母non-Saccharomyces在前期、中期和后期的数量分别占各发酵阶段菌株总数的24.7%、3.9%和0%,呈动态减少趋势。     

内蒙古西部赤霞珠葡萄自然发酵酵母菌群的动态变化

在无菌条件下,对内蒙古西部地区赤霞珠葡萄汁进行自然发酵,分别在发酵初、中、后期分离酵母菌株,采用WL营养琼脂对其进行形态学分类,采用基于酵母5.8S rRNA-ITS区域的RFLP(restriction fragment length polymorphism)分析对分类酵母菌株进行分子生物学鉴定,统计不同发酵时期发酵液中酵母菌株的种类及数量。结果表明,分离到的327株酵母菌分属于5个属的5个酵母菌种,分别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、克鲁维毕赤氏酵母(Pichia kluyveri)、浅黄隐球酵母(Cryptococcus flavescens)及葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum);自然发酵初期,葡萄汁有孢汉逊酵母、克鲁维毕赤氏酵母的数量占据优势,分别占分离总菌株数的64.22%、17.43%;随着发酵进行,非酿酒酵母(non-Saccharomyces)菌株的数量有所减少,酿酒酵母的数量逐渐增加,至发酵后期,发酵液中仅能检测到酿酒酵母的存在。这表明内蒙古西部地区野生酵母菌种较为丰富,WL营养琼脂形态学分类法结合酵母5.8S rRNA-ITS区域的RFLP分析能够快速分类、鉴定野生酵母菌种,实时监测发酵液中酵母菌群的动态变化趋势。     

云南弥勒葡萄酒产区云中舞葡萄酵母菌多样性研究

【目的】云南弥勒是中国西南地区传统的葡萄酒产区,以该产区云中舞葡萄为试验材料,对其果皮以及自然发酵过程中酵母菌的多样性进行研究。【方法】利用WL培养基的菌落培养形态,酵母细胞微观形态和分子生物学相结合的分类鉴定方法对弥勒云中舞葡萄果皮以及自然发酵过程中酵母菌进行分离鉴定和多样性分析。【结果】从云中舞葡萄分离得到的80株酵母菌共分为5个培养类型,采用26S r DNA D1/D2区序列分析对选出的具有典型特征的15株酵母菌进行了分子生物学鉴定,序列比对分析和WL培养基聚类表明80株被测菌株鉴定为5属5种,分别为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola)、库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)和桔假丝酵母(Candida quercitrusa),显示了酵母菌种类多样性;其中葡萄汁有孢汉逊酵母占了所分离酵母总数的43.18%,为弥勒云中舞葡萄相关酵母菌的优势种。通过构建15株被测菌株与相关模式菌株的系统发育树,分析酵母菌的遗传多样性和菌株间的亲缘关系,结果表明:各供试菌株均与各自相关模式菌株聚为一枝,和序列比对鉴定结果相一致。另外,鉴定为同种酵母的不同菌株间以及和模式菌株间的亲缘关系具有一定的差异,显示了一定的遗传多样性。【结论】云南弥勒云中舞葡萄相关酵母菌具有多样性的特点,本研究为进一步选育优良的本土葡萄酒酵母提供了材料和参考。     

北京地区一株葡萄酸腐病相关酵母菌的分离鉴定

近年来葡萄酸腐病在中国葡萄主要产区发生普遍而严重,已成为葡萄生产上的重要病害之一,但目前该病害的病原不明确且存在争议。采用组织分离法从北京地区采集的葡萄酸腐病病果上分离纯化出一株酵母菌sf-19,采用形态学特征观察、Biolog微生物自动分析系统和26SrDNA D1/D2区序列分析,将菌株sf-19鉴定为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)。致病性测定发现,酵母菌sf-19菌株可引起葡萄果实腐烂,且从接种腐烂的果实中又分离出葡萄汁有孢汉逊酵母。结果表明:葡萄汁有孢汉逊酵母是引起中国葡萄酸腐病的相关酵母菌之一。     

新疆酿酒葡萄园可培养酵母菌多样性分析

对新疆石河子和吐鲁番2个地区酿酒葡萄园可培养酵母菌的种类鉴定及分布进行研究,旨在明确酿酒葡萄园主要酵母种类及分布规律,为酵母菌资源的开发利用打下基础。对酿酒葡萄园果实表面和土壤进行稀释后平板划线分离纯化,挑取单菌落,并对菌落和细胞显微特征进行形态观察。对分离获得的酵母菌株进行WL培养基培养观察,区分聚类,选取其代表菌株进行糖发酵及碳源利用试验,且对其26S rDNA D1/D2区序列测序鉴定并进行系统进化分析。结果发现,从酿酒葡萄园土壤及果实表面中共分离获得41株酵母菌株,其中在石河子地区分离获得28株,经鉴定属于隐球酵母属(Cryptococcus)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、威克汉姆酵母属(Wickerhamomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、棒孢酵母属(Clavispora)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、假丝酵母属(Candida)、Rhodosporidiobolus和Kazachstania等10属13种,在吐鲁番地区共分离获得13株,经鉴定属于棒孢酵母属(Clavispora)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Kazachstania和Rhodosporidiobolus等6属6种。结果表明,新疆酿酒葡萄园的酵母菌组成具有较为丰富的多样性,其应用价值值得进一步研究。     

本土酵母与商业酵母混菌发酵对“马瑟兰”干红葡萄酒品质的影响

从贺兰山东麓葡萄酒产区筛选出适合该产区“马瑟兰”干红葡萄酒的本土酵母,与酿酒酵母CECA以1∶1混合发酵“马瑟兰”干红葡萄酒。结果表明：通过葡萄酒理化指标检测结果可知,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae,5号)、毕赤酵母属克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri,8号)、有孢汉逊酵母属葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum,12号)、红酵母属胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa,13号)、梅奇酵终属美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima,14号)在葡萄酒酿造中均具有良好的酿酒特性和广阔的应用前景。通过葡萄酒香气成分检测结果可知,8号酵母菌与酿酒酵母CECA混合发酵和5号酵母菌单独发酵“马瑟兰”干红葡萄酒中乙酸异戊酯、异戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、异戊酸乙酯、月桂酸乙酯、α-乙酸萜品酯、苯乙醇、香茅醇、异丁醇的浓度较高,具有果香与花香浓郁的特点,尤其8号酵母菌与酿酒酵母CECA混合发酵具有蜂蜜及淡甜味。     

不同树龄葡萄自然发酵过程中酵母菌的研究

【目的】研究葡萄树龄与葡萄自然发酵过程中葡萄酒相关酵母菌之间的关系。【方法】利用WL营养培养基,对分离自华夏长城葡萄酒厂葡萄生产基地、不同树龄(2,3,5年)西拉葡萄自然发酵液的240株酵母菌进行了聚类分析。【结果】240株酵母菌共分为5个WL营养类型。结合酵母菌菌株5.8 S rDNA-ITS区基因序列分析,不同树龄西拉葡萄自然发酵液中的酵母菌共有5种,分别为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、陆生伊萨酵母(Is-satchenkia terricola)、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、浅黄隐球酵母(Cryptococcus flavescens)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)。不同树龄西拉葡萄自然发酵过程中酵母菌的种类及其比例是变化的。【结论】用树龄较高的葡萄发酵,可加速发酵的启动,缩短发酵周期,同时有利于性状优良野生酿酒酵母菌株的筛选。     

不同逆境对葡萄酒相关酵母生长特性的影响

为了探究葡萄酒相关酵母对不同逆境的耐受性,从内蒙古西部酿酒葡萄产区分离到4株葡萄酒酵母,分别为葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)及克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)。采用杜氏小管发酵法测试这4株酵母对不同逆境(低p H、高酒精度、高浓度SO2、高浓度葡萄糖及高浓度盐)的耐受性。结果表明,葡萄汁有孢汉逊酵母耐低p H能力、耐高SO2能力与耐高盐能力最弱;酿酒酵母耐酒精能力强,耐高糖能力最弱;东方伊萨酵母耐高盐能力弱,耐SO2能力最强;克鲁维毕赤酵母耐酒精能力与耐高盐能力最强。     

宁夏葡萄自然发酵过程中酵母菌的分子生物学鉴定

【目的】探明宁夏地区葡萄自然发酵过程中酵母菌的多样性,为酵母菌资源的开发利用提供依据。【方法】应用26S rDNA D1\D2区序列,分析鉴定了分离自宁夏广夏三基地葡萄园的21株野生葡萄酒酵母菌,在此基础上又构建了21株被测菌株与相关菌种模式株的系统发育树,分析了供试菌株与已知酵母菌的亲缘关系及其分类地位。【结果】序列分析和系统发育树分析表明,21株被测菌株鉴定为6属7种,分别为拜耳接合酵母(Zygosaccha-romyces bailii)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、罕见有孢汉生酵母(Hanseniaspora occidentalis)、葡萄汁有孢汉生酵母(Hanseniaspera uvarum)、美极梅齐酵母(Metschnikowia pulcherrima)、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientali)和克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)。【结论】宁夏葡萄酒产区的相关酵母具有多样性。     

猕猴桃生香酵母筛选鉴定及其发酵特性

从多年野生猕猴桃树叶、枝干、果皮及树下土壤中分离猕猴桃生香酵母,研究其发酵特性,旨在开发猕猴桃酒发酵菌株.通过CO2失重比较、香气嗅闻、猕猴桃果汁发酵等分离出1株生香酵母,经形态观察、生理生化试验和26S rDNA基因序列同源性分析,鉴定为葡萄园有孢汉逊酵母(Hanseniaspora vineae),命名为X-5.随...     

张裕摩塞尔十五世酒庄酿酒葡萄酵母菌分离筛选及鉴定

[目的]为进一步探究张裕摩塞尔15世酒庄酿酒葡萄酵母菌的多样性,更好开发利用酒庄酵母菌资源。[方法]从张裕摩塞尔十五世酒庄的葡萄园土壤、葡萄浆果表皮以及葡萄自然发酵过程中进行酵母菌的分离筛选,对得到的32株酵母菌株运用 WL营养琼脂培养基进行初步分类,同时结合26S rDNA D1/D2区序列分析。[结果]共鉴定出克鲁维毕赤酵母（Pichiakluyveri）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniasporauvarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、大隐球酵母（Cryptococcus magnus）共4种酵母菌。[结论]初步确定张裕摩塞尔15世酒庄酿酒葡萄酵母菌的主要种类,为酿造具有酒庄特色葡萄酒提供理论基础和研究依据。     

甘肃野生酵母菌株的鉴定及抗性评价

采用形态和生理生化鉴定方法及26S rDNA D1/D2区序列分析,对甘肃部分县市的17份土样中分离到的29株野生酵母菌株进行了鉴定.结果显示,29株酵母归为10属18个种,其中优势属为隐球酵母属(4个种),假丝酵母属(4个种),毕赤酵母属(3个种);中国新记录种7个,包括Williopsis californica,Williopsis californicavar.dimennae,Cryptococcus aerius,Candida pseudolambica,Candida fermentati,Hanseniaspora occidentalis,Pichia pijperi.同时对这29株酵母进行了抗性评价,菌株38A(Candida tropicalis)耐60%的葡萄糖,45℃高温和14%NaCl.     

刺参机体酵母菌组成及其拮抗活性的研究

采用PDA、YPD、MEA培养基从刺参Apostichopus japonicus的体表、肠道和呼吸树分离出23株酵母菌,使用玻璃珠破碎方法提取其DNA,然后用酵母菌通用引物NL-1/NL-4从DNA中成功扩增出26S rDNA片段,将PCR产物迸行测序,将各菌株序列在GenBank数据库中进行检索,从Blast比对结果中取相似性最高的序列,用Mega 4.0软件对所有序列进行聚类分析,采用邻接法构建系统发育树.结果表明:从大连柏岚子海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、梅奇酵母属和丝孢酵母属,从大连市黑石礁海域刺参中分离出的菌株分别属于红酵母属、假丝酵母属、德巴利氏酵母属、有孢汉逊酵母属和毕赤酵母属;以8株刺参病原菌作为指示菌,采用双层琼脂扩散法对分离菌株的拮抗活性进行测定,获得拮抗酵母菌17株,占总测试菌株的73.9％,从刺参机体的体表、肠道和呼吸树可以筛选出不同得率的活性菌株,其抗菌谱和活性强度各不相同,其中C11菌株的抗菌谱最广,抗菌活性最强;从肠道分离出的拮抗菌C11、C14和C21菌株的胞外产物经硫酸铵沉淀后也具有抗菌活性,C14菌株胞外产物经65％硫酸铵沉淀获得的粗提物对热和蛋白酶K敏感,表明其拮抗物质为蛋白质.     

来源于Thermomyces sp.的植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达

[目的]研究植酸酶基因在毕赤酵母中的组成型表达。[方法]用PCR方法从嗜热真菌(Thermomyces sp.)中扩增到去除信号肽和内含子后约1.4 kb的phyT基因编码区片段,并对该片段进行克隆与序列测定。[结果]序列相似性分析表明,克隆的植酸酶基因无信号肽和内含子,与报道的嗜热真菌Thermomyces lanuginosus植酸酶基因相似性最高,DNA序列相似性为95%。从验证后的转化子筛选得到了表达嗜热真菌植酸酶的重组毕赤酵母菌株p-phy T,SDS-PAGE分析显示其分子量约为45 kD,重组毕赤酵母成功表达植酸酶。与野生型菌株相比,结果显示重组植酸酶酶活性提高了12.6%,最适温度65℃,75℃仍有64%以上酶活活性;最适pH值为5.5。[结论]嗜热真菌植酸酶基因用组成型质粒能在毕赤酵母中表达。     

乳源降血压七肽基因在毕赤酵母中的表达研究

利用基因工程技术在毕赤酵母中高效表达乳源抗高血压七肽,为大规模生产抗高血压肽奠定基础。根据毕赤酵母密码子偏爱性,人工合成了具有较高活性的抗高血压七肽串联基因序列。将串联基因克隆至表达载体pPIC9上,并转化毕赤酵母GS115,经PCR检测获得2株重组菌株。重组菌经甲醇诱导,表达的分泌蛋白经胰蛋白酶酶解,测定酶解产物抑制ACE酶活性。结果表明,表达蛋白的胰蛋白酶酶解产物抑制ACE酶活性达到65.12%。IC50值为0.0203 mg.mL-1。研究成功合成了串联的13拷贝抗血压七肽基因,并实现了其在毕赤酵母中的高效表达,表达蛋白的胰蛋白酶酶解产物具有抗高血压肽活性。     

棉铃虫葡萄糖氧化酶HaGOX在毕赤酵母中的重组表达和性质研究

毕赤酵母是使用最广泛、最具有发展前景的异源蛋白表达系统之一。在毕赤酵母GS115中实现了来源于棉铃虫(Helicoverpa armigera)葡萄糖氧化酶基因hagox的异源表达。以棉铃虫hagox基因连接pPICZαA质粒构建重组表达载体,电击转化毕赤酵母GS115H菌株后得到含有hagox基因的重组酵母菌株。通过平板显色、酶活力测定和SDS-PAGE分析,重组酵母中HaGOX成功表达。HaGOX含606个氨基酸,理论分子量66.9 kD,预测等电点pH 4.78。经测试重组HaGOX的最适pH为6.0～7.0,最适温度为40℃,对6-脱氧-葡萄糖和D-葡萄糖具有高催化活力,以D-葡萄糖为底物的比活力为13.63 U·mg~(-1),对其他吡喃糖和二糖没有催化活力。     

O型口蹄疫病毒VP1-2A基因及多表位片段在毕赤酵母中的表达

利用毕赤酵母表达系统串联表达O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1-2A基因及O型FMDV多表位片段(CTE),将O型FMDVvp1基因和CTE多表位片段克隆到毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K中,构建重组表达载体pPIC9K-VP1-2A-CTE并测序。经SalI线性化后,通过电击转化法将重组质粒导入毕赤酵母GS115中,并对表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。重组质粒通过电转进入毕赤酵母后,能表达相对分子量为41.8KD(CTE)和26.5KD(VP1-2A)的蛋白,经Western blot分析,两种蛋白均具有抗原性。在毕赤酵母中成功地表达O型FMDVVP1-2A蛋白和多表位片段(CTE),为研制新型口蹄疫的基因工程疫苗奠定了基础。     

刺果甘草多倍体诱变育种的研究

采用改良琼脂涂抹法(0 2%浓度的秋水仙碱与0 1%的琼脂混合成半固体)和直接滴渗法处理刺果甘草(G.Pallidiflora.)幼苗顶芽进行多倍体诱变,并比较不同方法和不同处理时间的变异率,以期获得最有效的多倍体诱变方法。结果表明:用改良琼脂涂抹法处理2天效果最好,变异率达55%。所以,改良琼脂涂抹法是一种非常高效的多倍体诱变方法。     

新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一。用于毕赤酵母表达系统的表达载体种类繁多,却因需要甲醇诱导表达或者基因转化过程中引入抗生素基因而限制了其在食品行业中的应用。研究设计以毕赤酵母组成型启动子-GAP启动子替换毕赤酵母表达载体pPIC9上的甲醇诱导型启动子AOX,成功构建了毕赤酵母组成型表达载体pGAPHα。并以里氏木霉木聚糖酶基因xyn2为报告基因进行功能验证,结果表明,该载体可实现xyn2基因在毕赤酵母中的高效表达。在此基础上以经密码子优化后的克鲁维酵母菊粉酶基因信号肽INU替换载体上原有的α-Factor信号肽,结果表明,INU信号肽能够有效引导XYNII的分泌。     

紫花苜蓿高频植株再生体系的建立

研究了不同品种间愈伤组织诱导及植株再生的差异.结果表明,MS+2,4-D(2.0 mg/L)+6-BA(0.5mg/L)+蔗糖0.3%+琼脂0.08%,MS+KT(0.5 mg/L)+NAA(0.01 mg/L)+蔗糖0.3%+琼脂0.08%,1/2MS+NAA(0.01 mg/L)+蔗糖0.15%+琼脂0.08%分别是紫花苜蓿的愈伤组织诱导、芽、根分化的适宜诱导培养基.