鱿鱼肌肉组织细菌基因组DNA提取方法的优化

采用十二烷基苯磺酸钠（SDS）法结合十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、SDS法结合溶菌酶法和CTAB法结合溶菌酶法对鱿鱼肌肉组织中细菌基因组DNA的提取效果进行比较。结果表明,SDS法结合CTAB法和SDS法结合溶菌酶法提取细菌总DNA的效果相近,CTAB法结合溶菌酶法提取细菌总DNA的效果相对较差,3种方法所提取的细菌总DNA纯度均较高,无需纯化即可进行进一步PCR扩增试验。变性梯度凝胶电泳结果说明,SDS法结合CTAB法较另两种方法能更真实地揭示待测样本中微生物的实际组成。     

PCR-DGGE方法分析玉米及苜蓿青贮动态发酵体系中菌群多样性

[目的]探讨玉米青贮和苜蓿青贮动态发酵过程。[方法]以玉米和苜蓿为青贮原料,利用氯化苄方法对青贮中微生物基因组DNA进行提取,以P2f和P3r为引物扩增目的片段并利用PCR—DGGE方法对玉米青贮及苜蓿青贮进行动态发酵多样性研究。[结果]玉米青贮的pH值在发酵过程中维持在4．0～4．5,而苜蓿青贮则维持在5．5—6．0。PCR-DGGE分析显示2种物料青贮在0和1d、3和7d、20和60d相似性均很高,并且它们具有基本相似的谱带类型,其中条带1、3、13、14、17、21、22为所有样品共有,只是亮度上有差异。DGGE研究结果表明大多数序列代表乳酸菌（LAB）类细菌,并以Lactobacillus类最多;其次为Lactococcus和Weissella。[结论]该研究为青贮添加剂的制作奠定基础。     

鸡生长发育中盲肠微生物菌群结构的PCR-DGGE分析

研究依莎褐蛋鸡和艾维茵肉鸡发育正常及迟缓鸡群的盲肠细菌种群结构和多样性变化。使用基于16S rDNA的PCR-DGGE技术,结合割胶回收DNA进行克隆和测序,分别对4、6、10、16、20和40周龄蛋鸡及1、2、4、6、7和8周龄肉鸡发育正常、迟缓鸡群盲肠内容物的细菌群落进行特异性引物图谱指纹和聚类分析,鉴定特异性和共性群落。结果表明,Lactobacillus属在两品种发育正常鸡群盲肠内容物细菌的相似性均高于迟缓鸡群,两品种各周龄和发育正常、迟缓鸡群间指纹图谱平均条带数差异显著（P〈0.05）。而Bacteroides属在发育正常鸡群盲肠内容物细菌的相似性与迟缓鸡群较为相近;发育正常、迟缓鸡群间平均条带数差异显著（P〈0.05）。Clostridium属在蛋鸡20、40周龄的平均条带数差异不显著（P〉0.05）,但肉鸡各周龄和发育正常、迟缓鸡群间的平均条带数差异显著（P〈0.05）。序列测序结果,Lactobacillus属在蛋鸡产蛋期发育正常、迟缓鸡群均定居于Lactobacillus agilis;而育雏和育成期定居于Lactobacillus aviaries和不可培养的细菌。两品种发育正常、迟缓鸡群均定居于Bacteroides属的Bacteroides acidifaciens、Uncultured bacterium,而发育正常、迟缓蛋鸡群存在Clostridium属Uncultured proteobacterium,发育正常肉鸡群定居Shigella sonnei,而两品种发育迟缓鸡群均缺乏此类菌种。结果显示,依莎褐蛋鸡和艾维茵肉鸡群各饲养阶段盲肠细菌群落差异显著,对鸡群正常生长发育影响较大。     

网箱养殖青石斑鱼Epinephelus awoara鳃及体表粘附菌群的PCR-DGGE比较分析

采用免培养的16S rDNA梯度凝胶电泳技术（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）对海水网箱养殖青石斑鱼Epinephelus awoara鳃和体表粘附菌群结构进行了比较分析。结果表明青石斑鱼鳃粘附菌群结构相对简单,存在绝对优势种群,体表粘附菌群结构较为复杂,无绝对优势种群,聚类分析表明青石斑鱼鳃与体表粘附菌群结构存在较大差异性（相似度52%）,而个体间鳃或体表的粘附菌群结构相似性较好。测序结果表明青石斑鱼鳃与体表粘附菌群以未培养菌为主,鳃的绝对优势菌为Panntoeasp.,体表相对优势菌为Meio-thermussp.、UnculturedAcinetobactersp.、Wautersiella falsenii与未培养菌,提示在生产实践中采用复合菌制剂似乎更为可行。PCR-DGGE技术能区别青石斑鱼鳃与体表粘附菌群的多样性,在可定植益生菌筛选上具指导意义。     

好氧脱氮菌群的筛选驯化及PCR-DGGE分析

通过脱氮培养基定向筛选驯化好氧脱氮有效生物菌群,该有效生物菌群能在好氧的条件下将氨氮转化为N2排放,24h氨氮去除率达到90.3%,且无中间产物亚硝态氮和硝态氮的积累.其间通过PCR-DGGE方法分析驯化各阶段的微生物群落结构,当群落结构无明显变化且氨氮去除率相对稳定,说明驯化阶段基本完成.该好氧脱氮有效菌群具有培养基...     

PCR-DGGE技术分析合生素对肉仔鸡盲肠菌群结构的影响

试验研究合生素对肉仔鸡盲肠微生物区系的影响。选择1日龄肉仔鸡450只,随机分成5个处理,分别饲喂基础日粮、基础日粮+抗生素、基础日粮+益生素、基础日粮+益生元、基础日粮+合生素,每个处理3个重复,每个重复30只鸡。在21,42日龄每个重复选择2只鸡,无菌采集盲肠内容物,提取细菌基因组总DNA,PCR扩增16s rDNA V3区,扩增产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)后分析细菌群落结构的变化。结果表明,在214,2日龄,日粮添加合生素处理组试验鸡盲肠DGGE条带数均高于其他处理组,合生素组试验鸡盲肠内容物菌群多样性高于其他试验组。序列分析发现肉仔鸡盲肠中特异条带主要来源于不可培养的拟杆菌属、普雷沃氏菌属、梭菌目细菌和其他大量种属关系未知的细菌。     

鱿鱼及其制品中内源性甲醛产生的机制和控制方法研究进展

近年来我国水产品质量安全问题频发,尤其是鱿鱼产品中的甲醛含量超标问题尤为突出,关系到整个鱿鱼产业乃至全国水产加工产业的生存与发展,亟待解决。而鱿鱼及其加工制品中的甲醛主要来源于自身的物质代谢,因此就鱿鱼及其加工制品中内源性甲醛的主要形成机制即氧化三甲胺酶催化途径和氧化三甲胺高温裂解途径,以及甲醛的控制即甲醛捕获剂、氧化三甲胺酶的抑制剂、加工工艺改进和产品包装等进行了阐述,并针对目前研究的现状提出了鱿鱼制品中内源性甲醛研究的新方向,即货架期内甲醛的形成机制和控制方法。     

利用PCR-DGGE方法研究添加复合菌剂对堆肥微生物群落的影响

为研究接种复合菌剂对堆肥微生物群落变化的影响,以奶牛粪便和稻草为原料进行堆肥试验,设添加复合菌剂BLD(由3株木质纤维素降解细菌组成,经测序鉴定分别为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌属中未鉴定种)和不加菌剂两个处理,利用传统平板培养与聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法相结合研究两种堆肥处理对微生物群落演替的影响.结果表明,基于传统培养方式,微生物数量呈升高-降低-升高-降低的趋势,且细菌数量明显大于真菌数量;DGGE图谱显示,两种堆肥处理的条带数呈现与传统培养相似的变化趋势.接种菌株在堆肥初期成功定殖,高温期成为优势菌株,降温期优势逐渐减弱.接种菌剂增加了堆肥中细菌数量,提高了堆肥微生物群落多样性,从而促进堆肥微生物群落演替,缩短堆肥腐熟时间.     

应用PCR-DGGE比较奶牛瘤胃中不同粗饲料固相粘附细菌的多样性

为了比较奶牛瘤胃中不同粗饲料粘附细菌菌群结构,选择3头体况相近、健康、装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛,将苜蓿与全株玉米青贮混合粗饲料日粮(MF)和单一玉米秸秆日粮(CS)分别装入尼龙袋,在瘤胃中孵育24h后取出,用磷酸缓冲液洗脱获得饲料固相粘附部分,剩余的饲料残渣是固相超紧密粘附部分,提取总DNA,最终获得固相紧密粘附细菌和固相超紧密粘附细菌,利用PCR-DGGE分析细菌群落结构.结果表明:不同粘附程度的固相细菌的DGGE图谱条带数目和颜色深浅存在较大的差异,而粘附程度相同的不同粗饲料的DGGE图谱条带相似.2种饲料的瘤胃固相紧密粘附细菌的Shannon-Wiener多样性指数,CS高于MF(P<0.05),相比于固相紧密粘附细菌,固相超紧密粘附细菌的Shannon-Wiener多样性指数更高(P<0.01).不同粘附程度的固相细菌差异条带近源种分别归属于Brevundimonas,Prevotella,Pseudobutyrivibrio,Clostridium.因此认为,粗饲料类型和粘附程度影响细菌多样性,其中固相超紧密粘附细菌的多样性较高.     

加工工艺及壳聚糖对鱿鱼中多环芳烃形成的影响

[目的]以秘鲁鱿鱼为研究对象,探究加工工艺及壳聚糖处理对鱿鱼加工过程中多环芳烃生成的影响。[方法]探究了不同时间(2、3、4、5 min)、温度(120、140、160、180℃)、食用油种类(棕榈油、花生油、菜籽油、大豆油)、烹饪方式(煎、烤、炸)、鱿鱼皮去除与否以及2 g/L壳聚糖和羧甲基壳聚糖溶液浸泡处理对鱿鱼中多环芳烃生成的影响。[结果]随着加工时间的延长和温度的升高,鱿鱼中多环芳烃总量及苯并[a]萞含量也逐渐增加;经不同的食用油加工鱿鱼后,多环芳烃的生成量从低到高依次为棕榈油、大豆油、菜籽油、花生油(P<0.05)。采取烤的方式所生成的多环芳烃总量最低,苯并[a]芘含量在煎的方式下最低;去除鱿鱼皮能够有效降低加工过程中多环芳烃的生成量(P<0.05);壳聚糖处理组的鱿鱼经2、3、4、5 min加工处理后,多环芳烃总量较CK显著降低(P<0.05),下降率分别为30.28%、28.17%、19.37%、5.77%;苯并[a]芘含量也显著下降(P<0.05),下降率分别为32.35%、41.03%、45.45%、69.52%;羧甲基壳聚糖处理组鱿鱼经2、3...     

西北太平洋中上层鱼类和鱿鱼的组织能量密度与海域环境的关系

为探求西北太平洋生物种类的能量存储能力,本研究利用“淞航”远洋渔业调查船采集的鱼类和鱿鱼样本,利用组织能量密度测定技术分析其肌肉组织能量密度,并利用混合模型分析组织能量密度与海洋环境因子的效应关系。结果显示,鱼类比鱿鱼的肌肉组织能量密度大,前者为(23.50±2.80) kJ/g,后者为(19.67±1.16) kJ/g。鱼类中以汤氏角灯鱼的肌肉组织能量密度最大,为(28.75±0.96) kJ/g;日本栉鲳的组织能量密度最小,为(20.37±1.04) kJ/g。鱿鱼中以发光柔鱼的肌肉组织能量密度最大,为(20.07±0.39) kJ/g;日本爪乌贼的组织能量密度最小,为(18.42±0.22) kJ/g。在纬度较高的海域,鱼类和鱿鱼具有较大的肌肉组织能量密度,而且与经度×纬度显著相关(p<0.05)。鱼类和鱿鱼在海平面高度0m时具有较大的肌肉组织能量密度,且在净初级生产力>12 mg/m3/d时呈增大变化趋势;然而,两者的肌肉组织能量密度随海表温升高而降低。研究表明,西北太平洋鱼类和鱿鱼的肌肉组织能量密度存在纬向变化趋势,海域的海平面高度、海表温和净初级生产力对其单位质量组织的能量存储产生显著影响。本研究可为认知西北太平洋生物种类的环境适应特性,以及开展海洋生态系统稳定性研究提供数据基础。     

崂山奶山羊瘤胃微生物总DNA提取方法的优化

对瘤胃微生物总DNA提取方法进行了改进,将冻融法和CATB法相结合,可以将细菌、真菌和古细菌在内的各种微生物的细胞壁充分的粉碎,且DNA提取效果稳定,可以获得足够大的DNA片段(23 kb),可以满足后续试验的需要.     

玉米和苜蓿青贮发酵体系中菌群多样性的PCR-DGGE分析

利用PCR-DGGE研究玉米和苜蓿青贮在动态发酵过程中菌群的变化.结果表明,苜蓿青贮在青贮过程中菌群组成比较稳定,DGGE图谱上没有出现明显的条带增加或减少,青贮不同时间DGGE谱带相似性超过了79%;而玉米青贮在发酵3 d以后细菌种类和数量明显减少,0～3 d和7～60 d谱带的相似性不足50%;自然青贮(无论是玉米青贮还是苜蓿青贮)后期的优势菌群来源于未青贮前原料表面的原始菌群.在后续试验中对19条条带进行回收、测序,其中15条克隆成功,包括?-Lactococcus、?-Acinetob-acter、?-Streptococcus、?-Weissella、?-Pantoea、?-Escherichia、?-Enterobacter和?-Endophytic bacterium等几大类群.     

土壤镰刀菌种群检测的巢式PCR-DGGE方法的建立

本试验比较了4种提取小麦-玉米轮作免耕田土壤DNA的方法,并对巢式PCR反应体系和扩增条件进行了优化,建立了适合检测土壤中镰刀菌多样性的PCR-DGGE体系。结果表明:土壤DNA的质量是影响PCR扩增结果的关键因子,试剂盒Fast DNA SPINfor Soil所提土壤DNA片段接近23 bp,A260/A280比值为1.84,DNA产量为18.1μg/g,更适合进行PCR反应。DNA模板的浓度决定PCR扩增结果,第一轮PCR扩增的DNA模板适宜量为2～5 ng,以第一轮PCR产物的原液为模板进行第二轮PCR扩增,在退火温度为67℃时扩增结果最好。PCR产物在变性范围为45%～60%的丙烯酰胺梯度凝胶中电泳7～8 h,其条带能够完全分离,可以用作土壤中镰刀菌多样性的检测。     

土壤中微生物DNA高效提取方法的筛选

设计了3种从土壤中直接提取微生物DNA的方法,并通过PCR扩增和DGGE电泳比较了不同方法所提取DNA的质量以及对后期分子生物学研究的适用性。结果表明,化学法和酶法相结合的提取方法所获得的DNA完整性最好,适用于PCR扩增,并且通过DGGE电泳分离出最丰富的条带,是一种高效的提取土壤微生物DNA的方法。     

葛根淀粉提取工艺优化与同时富集回收总异黄酮的方法

旨在采用匀浆法优化葛根淀粉提取工艺并同时利用大孔吸附树脂富集回收其水提液中的总异黄酮。通过单因素及正交试验设计优化葛根淀粉的提取条件,同时考察葛根总异黄酮的溶出效果,最后用大孔树脂吸附法富集回收匀浆提取液中的总异黄酮。结果表明,用匀浆法提取葛根淀粉的最佳工艺条件为液料比8 mL∶1 g、匀浆时间30 s,洗涤时的液料比为6 mL∶1 g,在此条件下淀粉的收率为(18.58±0.26)%(n=3,相对标准偏差=1.38%),总异黄酮在水中的溶出率为(1.49±0.05)%(n=3,相对标准偏差=3.37%)。D101大孔树脂对葛根总异黄酮的动态饱和吸附容量可以达到30.12 mg/mL,70%乙醇的洗脱率达到86.89%,样品中的总异黄酮含量(紫外比色法)可以达到50.91%,其中葛根素的含量(高效液相色谱法)为28.77%。该研究方法操作简单易行,提取溶剂价格低廉且环保,淀粉、总异黄酮的收率都较高,回收的总异黄酮纯度也较高,减轻了葛根淀粉提取加工过程中排放水对环境的污染,高效合理利用了葛根资源,能够为中小型葛根加工企业对葛根淀粉的提取加工及资源化综合利用提供科学依据。     

3种DNA提取方法对养殖池塘不同生境菌群PCR-DGGE分析的影响

比较3种DNA提取方法(溶菌酶法、CTAB法及珠磨法)对养殖池塘几种生境(底泥、饲料、草鱼肠道内容物及肠道壁)菌群PCR-DGGE分析的影响。结果表明,以3种提取方法获得的DNA为模板均能进行16S rDNA V3区特异性片段扩增;但不同DNA提取方法对池塘不同生境菌群DGGE指纹图谱存在显著影响。DGGE指纹图谱显示草鱼肠道内容物菌群(溶菌酶法)与肠道壁菌群(溶菌酶法)存在较高一致性,底泥菌群(CTAB法)及饲料菌群(溶菌酶法)与鱼体肠道菌群(包括内容物菌群和肠道壁菌群)则存在明显差异,但肠道菌群与底泥菌群的相似度相对更高。研究提示采用微生物分子生态学工具对养殖池塘不同生境进行菌群结构分析时,需提前优化DNA提取方法;在以投饲为主的养殖鱼塘中,草鱼肠道菌群更多源自于池塘底泥。     

牡丹种皮中芍药苷和丹皮酚的优化提取工艺

[目的]采用乙醇匀浆法优选牡丹种皮中芍药苷和丹皮酚的最佳提取工艺。[方法]在单因素试验基础上采用L9(34)正交试验设计,考察了乙醇浓度、料液比、匀浆时间、提取次数对芍药苷和丹皮酚提取得率的影响,以确定最佳提取工艺参数条件。[结果]最佳工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1∶20、匀浆时间4 min、提取1次。[结论]采用乙醇匀浆正交试验法优化的提取工艺可以有效提高牡丹种皮中芍药苷和丹皮酚得率。     

高效提取肠道菌群总DNA方法的建立

[目的]建立一种高效快速的提取肠道茵群总DNA的方法,即改进的氯仿抽提法,为进一步对肠道茵群的定性和定量提供基础。[方法]通过对多种肠道菌群总DNA提取方法的考察总结,对氯仿抽提法进行改进,采用细菌添加试验的荧光实时PCR检测抽提结果,同时与QIAamp DNA Stool Mini kit法进行比较,以验证所建立的改进的氯仿抽提法的高效性。[结果]改进的氯仿抽提法提取的肠道茵群总DNA量约是QIAamp DNA Stool Mini kit的100倍;同时细菌添加试验的实时荧光定量PCR结果显示,改进的氯仿抽提法提取添加细菌的DNA效率较高。[结论]改进的氯仿抽提法经济、高效、快速,适合大批量的粪便样品的DNA提取。     

水产品肌肉组织中氯霉素残留量检测方法的对比分析

初步比较了酶联免疫法(ELISA)中2种氯霉素试剂盒(荷兰EURO-DIAGNOSTICA试剂盒和德国r-Biopharm试剂盒)检测水产品氯霉素残留量的效果,并对测定水产品氯霉素残留量的气相色谱法(GC-ECD)和液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)的技术参数进行了比较分析。结果表明,荷兰EURO-DIAGNOSTICA试剂盒和德国r-Biopharm试剂盒的检测范围分别为0.025~2.0μg.L-1和0.05~4.05μg.L-1,其板内相对标准偏差均小于10%,2种试剂盒检测25个鱼或虾样品的假阳性率分别为12%和20%。LC-MS/MS和GC-ECD的最低检测浓度分别为0.1μg.kg-1和0.27μg.kg-1,当氯霉素添加量为2μg.kg-1时其平均回收率分别为95.2%和70.4%;LC-MS/MS样品前处理较简单,GC-ECD较繁琐。