草莓果实β-葡萄糖苷酶基因FaBG1克隆及成熟期表达分析

为了探讨脱落酸合成相关酶β-葡萄糖苷酶FaBGl基因是否参与草莓果实成熟的调控，本研究以‘红颜’草莓着色期间的果实为试材，首先通过RT-PCR技术克隆β-葡萄糖苷酶FaBGl基因的鳊码区核苷酸序列。该1，845bp基因在基因组中以单拷贝形式存在，并编码1个含有615氨基酸的多肽。生物信息学分析表明，FaBG7含有5个跨膜区，在进化上高度保守。围绕果实着色期间FaBGt基因转录水平以及ABA含量分析表明，随着果实的着色增加，FaBG7转录水平和ABA含量都逐渐增加，半红后基因表达量逐渐降低，ABA含量继续上升，至成熟时述到高峰。本研究结果表明FaBG7可能参与革摹果实的着色启动。     

草莓果实β-葡萄糖苷酶基因克隆及成熟期表达分析

为了探讨脱落酸合成相关酶β-葡萄糖苷酶基因是否参与草莓果实成熟的调控,本研究以‘红颜’草莓着色期间的果实为试材,首先通过RT-PCR技术克隆β-葡萄糖苷酶基因的编码区核苷酸序列.该1,845 bp基因在基因组中以单拷贝形式存在,并编码1个含有615氨基酸的多肽.生物信息学分析表明,含有3个跨膜区,在进化上高度保守.围绕果实着色期间基因转录水平以及ABA含量分析表明,随着果实的着色增加,转录水平和ABA含量都逐渐增加,半红后基因表达量逐渐降低,而ABA含量继续上升,至成熟时达到高峰.本研究结果表明可能参与草莓果实的着色启动     

森林草莓‘Ruegen’果胶裂解酶基因的克隆及荧光定量表达分析

根据森林草莓(Fragaria vesca)果胶裂解酶(Pectate lyase)基因序列信息设计引物,克隆了森林草莓‘Ruegen’的果胶裂解酶基因PLA、PLB和PLC。利用MEGA5.0软件将这3个基因编码的氨基酸序列与其他植物的果胶裂解酶氨基酸序列进行聚类分析,同时采用荧光定量PCR的方法对‘Ruegen’植株不同器官及不同发育时期果实的果胶裂解酶基因表达量进行分析。结果表明:PLA、PLB和PLC在其植株各器官中均有表达,且在发育后期果实中的表达量明显高于其他器官,结合进化树以及果实发育过程中果胶裂解酶活性变化,推测果胶裂解酶基因对草莓果实发育后期的软化具有调节作用。     

草莓9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2 228 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1 d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。     

森林草莓FvbHLH130转录因子调控植株提前开花

分析草莓碱性螺旋—环—螺旋（basichelix-loop-helix,bHLH）转录因子家族,鉴定到森林草莓（Fragaria vesca）花特异表达的转录因子基因FvbHLH130。FvbHLH130编码区序列长度为960 bp,编码319个氨基酸,保守结构域预测结果显示第247～297 aa是bHLH结合域,其属于bHLH家族成员。FvbHLH130启动子含有生长素等激素响应、逆境胁迫和低温响应元件,推测基因表达可能受到生物和非生物胁迫诱导。FvbHLH130蛋白氨基酸序列与月季（Rosa chinensis）的相似性高达93.70%,与其他蔷薇科bHLH蛋白聚在一个分支上,与拟南芥AtFBH4是同源蛋白。农杆菌介导的FvbHLH130拟南芥转基因株系提前7 d开花,且促进开花相关基因AtAP1、AtFT、AtFUL和AtCO的表达。酵母双杂交实验结果表明FvbHLH130与FvARF4和FvARF6互作,可能作为蛋白复合体共同参与开花调控。     

草莓花色苷物质鉴定及关键基因表达分析

建立了应用HPLC–MS/MS快速分离、鉴定草莓花色苷的方法，并对不同果色12个草莓品种的成熟果实进行花色苷定量和定性分析，同时对比分析草莓（Fragaria×ananassa，八倍体）和森林草莓（F.vesca，二倍体）基因组中花色苷合成相关基因的数量和染色体定位，通过RNA-Seq和qRT-PCR分析它们在果实发育过程中的转录水平变化。在草莓中检测到8种花色苷，包括首次检测到的芍药素–3–葡萄糖苷、芍药素–丙二酰葡糖苷和芍药素–3–甲基丙二酰葡糖苷。不同果色草莓果实中总花色苷含量差异较大，均以天竺葵素–3–葡糖苷为主。草莓基因组包含73个花色苷合成相关基因，是森林草莓的3～4倍，均匀分布在4套亚基因组上。RNA-Seq结果显示整体上多拷贝基因在草莓果实中的表达水平没有显著差异，未发生明显的偏向性表达。花色苷合成关键路径基因（PAL1、CHS、CHI、F3H、DFR1、ANS、UFGT），转运基因（GST）和转录因子基因MYB10在草莓果实成熟过程中表达量显著增加，尤其是花色苷积累期，表明这些基因在草莓果实花色苷积累中起关键作用。     

转录因子FaNAC56在草莓果实成熟中的功能分析

[目的]研究NAC转录因子FaNAC56在草莓果实成熟中的作用.[方法]根据前期果实成熟过程中的蛋白组数据,以八倍体红颜草莓为试材,克隆FaNAC56基因及其启动子.在蛋白水平,利用MEGA构建FaNAC56系统进化树,并通过生物信息学预测其编码蛋白的二级结构,以及利用烟草进行亚细胞定位;在转录调控水平,利用预测网站分析FaNAC56启动子区顺式作用元件以及下游靶基因,并通过RT-qPCR分析FaNAC56的时空表达模式.最后,利用果实圆片温育方法分析FaNAC56基因受外源激素诱导情况.[结果]FaNAC56基因全长1035 bp,编码344个氨基酸,具有NAC转录因子NAM保守结构域.系统发育分析表明FaNAC56与月季NAC56同源性最高.亚细胞定位显示FaNAC56定位于细胞核内.FaNAC56在果实中高度表达并随果实成熟表达量急剧增加.FFaNAC56启动子区含有ABA、赤霉素、生长素、乙烯等激素和胁迫相关响应元件,其表达水平受这些激素诱导.靶基因分析发现FaNAC56可能响应多种激素、花色苷和蔗糖调控元件.[结论]FaNAC56可能通过多种激素调控草莓果实的发育和成熟.     

草莓CIPK基因家族的鉴定与表达分析

从拟南芥数据库中获得CIPK基因家族注册号,运用生物信息学分析的方法,在蔷薇科森林草莓(Fragaria vesca)数据库中得到CIPK基因家族成员19个,可分为6个亚族。该基因家族分布在草莓7条染色体中的6条上。其编码蛋白的氨基酸数157～1 196,理论等电点3.91～9.34,分子量18 667.68～133 714.31 D。基因结构分析表明,有11条基因只有1个外显子,其余基因外显子数2～15。亚细胞定位结果表明,该基因家族成员主要在细胞质、细胞核和叶绿体上表达。蛋白质二级结构预测表明,该基因家族成员主要以α–螺旋、β–转角和不规则卷曲为主。对上游2 kb区域启动子顺式作用元件分析表明,该基因家族成员对逆境胁迫应答MYB响应明显,除FvCIPK02、FvCIPK15、FvCIPK17外,其他基因均对脱落酸应答元件ABRE响应明显。qRT-PCR数据分析表明,FvCIPK16、FvCIPK10和FvCIPK09分别在PEG、ABA和NaCl处理下,草莓试管苗中的相对表达量最高,分别是对照的18.4倍、29倍、13倍,说明FvCIPK16强响应干旱胁迫,FvCIPK10强响应ABA诱导,FvCIPK09强响应高盐胁迫;另外发现各处理的FvCIPK03相对表达量均下调,推测FvCIPK03在植物逆境胁迫中起负调节作用。     

森林草莓醇酰基转移酶基因FvAATW2功能研究

在从森林草莓(Fragaria vesca L.)成熟果实中克隆到醇酰基转移酶基因(FvAATW2)的基础上,构建由CaMV35S启动子驱动的植物正义表达载体pBI121-FvAATW2,在烟草(Nicotiana tabacum L.)和草莓(Fragaria×ananassa Duch.)‘Camarosa’品种中过量表达FvAATW2,以研究其功能。采用农杆菌介导的叶盘法转化烟草和草莓;利用PCR和Southern blot筛选出转基因株系;通过实时定量PCR和测定AAT酶活性来检测转基因植株中外源基因的表达;利用SPME/GC–MS方法检测烟草叶片和草莓果实中的挥发性成分。对转基因烟草外源基因表达和早期叶片挥发性成分的检测结果表明,构建的FvAATW2表达载体功能正常,转基因株系能够在生长早期合成酯类物质;通过检测转基因草莓成熟果实的酯类成分发现,与野生型对照相比,转基因草莓果实中酯类占挥发物的总比例以及乙酸辛酯、己酸乙酯、己酸辛酯、辛酸乙酯等挥发酯的比例显著提高,而丁酸甲酯的含量显著降低,辛酸乙酯的含量显著增加,说明外源FvAATW2在草莓中能够正常表达并影响果实酯类合成,从而通过改变挥发性酯类构成使果实香气变浓。     

枣类甜蛋白基因家族的鉴定与生物信息学分析

【目的】从枣全基因组中鉴定类甜蛋白(thaumatin like protein,TLP)基因,为枣TLP基因的功能研究与利用提供参考。【方法】通过生物信息学方法从枣基因组数据库中鉴定TLP基因家族成员,并对基因结构、进化、启动子区顺式作用元件和密码子使用性等进行分析。【结果】共鉴定到34个枣TLP基因,位于9条染色体上,分为4种结构类型,基因结构相对较简单;系统发育进化分析归为9个聚类组,其中聚类组5和聚类组6中的成员最多;基因启动子区发现多个与增强基因表达、激素响应和胁迫响应相关的元件;基因密码子使用偏性弱,基因进化主要受碱基突变的影响。【结论】枣基因组中含有34个TLP基因家族成员,数量相对偏少;在植物生长、果实发育和抵御胁迫过程中发挥作用;进化过程中主要受突变选择压力影响。该研究为TLP基因家族的功能分析和遗传育种应用提供了参考和借鉴。     

草莓9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2228bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。     

香蕉果皮2个HSP70基因片段的克隆及其在热激和冷藏过程中的表达

温度逆境胁迫可以诱导热激蛋白的表达,而热激处理能够减轻果实冷害。为了探讨温度逆境对香蕉热激蛋白基因表达的调控、辨析香蕉热激蛋白基因的表达与果实冷害的关系,采用同源序列法分离了香蕉果皮HSP70基因序列-根据已经报道的HSP70基因的氨基酸保守序列设计引物、以香蕉果皮总RNA为模板,用RT-PCR方法克隆香蕉的HSP70 cDNA,Northern杂交分析该基因在不同贮藏温度下的表达特征。结果得到2个序列不同的HSP70基因片段,分别命名为Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2,Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2之间的碱基同源性为86.9%,氨基酸同源性为97.1%。Northern杂交的结果表明,38℃短期热激处理诱导了Ma-HSP70-2基因的表达,低温冷藏能使2个基因的表达增强。并初步认为Ma-HSP70可能与香蕉果实耐冷性有关。     

Dof转录因子的全基因组分析揭示辣椒发育和响应生物胁迫的功能特征

Dofs(DNA-binding with one zinc finger proteins)是植物特有的转录因子家族。Dof蛋白参与许多生物过程,如植物激素的产生,种子发育和环境适应。Dof蛋白已经在多种植物中被鉴定,但在辣椒中尚未开展类似的研究。我们在辣椒中鉴定出了33个可能的Dof基因(CaDofs)。为了了解CaDof基因的特征,我们分析了其系统进化关系、蛋白质基序和进化历史。我们将含有25个基序且分布在8条染色体上的33个CaDof基因分成4个族。我们发现CaDof基因的扩张可追溯到最近的复制事件。茄科种系形成之前,片段复制在CaDof家族基因中占主导地位。通过RNA-seq分析获得了CaDof基因表达谱,发现在对包括两种TMV菌株,辣椒斑驳病毒和辣椒疫霉菌的生物胁迫响应过程中,Ca Dof家族基因表现出了时间和病原特异性变化,这表明CaDof基因的功能具有多样性。这些结果不仅为研究Dof基因在生物胁迫中的响应提供有价值的信息,同时也有助于更好地理解Dof基因在辣椒和其他物种中的多重功能。     

番木瓜ERF家族与果实成熟相关成员的分析

通过比较分析番木瓜ERF家族成员的系统进化关系、基本理化性质、保守基序、启动子顺式元件,结合分析番木瓜在乙烯利和乙烯抑制剂1–甲基环丙烯(1-MCP)处理下以及不同成熟期果肉的RNA-seq数据,筛选出22个ERF家族成员进行表达差异分析,最终比较得出两个处理数据中显著差异表达基因有18个,推测这些基因可能在番木瓜果实成熟过程中起重要作用。     

甜樱桃砧木PcMPK3基因启动子的克隆及对病原菌感染的响应

【目的】探明PcMPK3基因的表达调控规律。【方法】利用染色体步移技术从甜樱桃矮化砧木Gisela 6中克隆PcMPK3基因的启动子序列PcMPK3pro。利用Neural Network Promotor Prediction、softberry、PLACE和PlantCARE网站在线预测PcMPK3基因的基础启动子、转录起始位点和顺式作用元件。将PcMPK3pro定向替换植物表达载体pBI121-SN1的CaMV35S组成型启动子,构建重组表达载体pBI-PcMPK3pro:GUS,瞬时转化烟草叶片。【结果】结果表明,PcMPK3pro含有启动子核心元件TATA-box和CAAT-box等多种响应胁迫的顺式作用元件。受病原菌丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000,Pst DC3000)侵染,PcMPK3pro能驱动GUS报告基因表达且GUS酶活性显著提高。【结论】推测PcMPK3基因参与植物响应病原菌感染的胁迫过程。     

铁皮石斛热激蛋白HSP70家族基因鉴定及温度胁迫下的表达分析

为研究铁皮石斛(Dendrobium catenatum Lindl.)应对温度胁迫的响应机制,利用生物信息学方法对其热激蛋白HSP70家族基因进行鉴定。荧光定量PCR技术分析它们的组织表达特性,以及在高温(42℃)和低温(4℃)胁迫下的表达模式。从其基因组中鉴定出10个家族成员,其编码的氨基酸数在628～702之间,分子量在69.65～75.15 k D,理论等电点在5.12～6.18之间。进化树分析可将这10个蛋白分为4个亚族,且每个亚族蛋白的保守基元相似。基因结构分析表明,HSP70的内含子数量为1～7不等。HSP70在铁皮石斛中的表达具有组织特异性,在合蕊柱中最高。低温处理铁皮石斛组培苗后,DcHSP70-1和DcHSP70-7呈上调表达,推测其响应低温胁迫;高温胁迫下,Dc HSP70-2、DcHSP70-3、DcHSP70-5和DcHSP70-7的表达量上调比较明显,推测它们在响应高温胁迫中起主要作用。     

草莓FaWRKY31的克隆、亚细胞定位及表达特性分析

为明确草莓FaWRKY31的序列特征、表达特性和亚细胞定位情况,通过同源克隆的方法从八倍体草莓‘红颜’中得到3条长度为1 644 bp、1条长度为1 669 bp的cDNA序列和两条长度约为2 000bp的启动子序列。生物信息学分析表明:长度为1669bp的FaWRKY31-like因插入了一段25bp的短序列导致开放阅读框提前终止,缺失了WRKY结构域和C2H2锌指结构。启动子的序列分析结果表明:FaWRKY31与森林草莓FvWRKY31的启动子序列存在较大差异,相似性仅为70%,FaWRKY31的启动子序列发生了多个片段的缺失和插入,可能导致其与森林草莓FvWRKY31有不同的诱导特性。qRT-PCR结果表明:FaWRKY31在草莓的根、茎、叶、花及果实中均有表达,根中的表达量最高,全红期果实中的最低。FaWRKY31能同时响应红光和蓝光的调控,抑制其在草莓果实中的表达。此外,FaWRKY31能在不同程度上响应低钾、低磷、低温、ABA、盐害、干旱这6种非生物胁迫,且低温、ABA及干旱都显著抑制FaWRKY31的表达。亚细胞定位结果显示FaWRKY31蛋白定位于细胞核内。     

草莓生长素合成关键酶FveTAA1保守氨基酸位点T111的生物学功能研究

结合生物信息学、生物化学和遗传学等方法对森林草莓(Fragaria vesca)生长素合成通路色氨酸转氨酶TAA1(Tryptophan aminotransferase of Arabidopsis 1)进化过程中保守的氨基酸位点T111的生物学功能进行了研究。通过基因表达分析发现,草莓Fve TAA1在果实膨大及果实成熟阶段均上调表达,暗示其在果实发育过程中可能具有重要的生物学功能。通过生物信息分析发现,Fve TAA1蛋白的第111位苏氨酸(T111)在进化过程中高度保守,推测该位点可能具有重要的生物学功能。通过生物化学方法检测发现,该位点突变成模拟非磷酸化状态的丙氨酸T111A及模拟磷酸化状态的天冬氨酸T111D,其蛋白均丧失色氨酸转氨酶活性,因此推断该位点对其酶活性至关重要。通过遗传学方法发现,Fve TAA1WT能够回补拟南芥TAA1/TAR突变体的遗传表型,而Fve TAA1T111A与Fve TAA1T111D均无法回补,进一步证明了Fve TAA1 T111氨基酸位点在体内重要的生物学功能。本研究的结果不仅证明了生长素合成途径在进化上存在保守的调控机制,也为研究生长素...     

柑桔TIFY基因结构特征及响应低温表达分析

TIFY基因家族是一类包含TIFY结构域的植物特有转录因子,与植物的生长发育密切相关,且在非生物逆境响应中起着重要作用。"龟井2501"是温州蜜柑品种"龟井"的一个抗寒芽变品种。基于华中农业大学甜橙基因组数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php)数据,分析了3个TIFY基因家族成员(Cs1g17210、Cs1g17220和Cs4g07130)的基因结构特征,并利用qRT-PCR分析了经低温诱导后这些基因在"龟井2501"植株叶片中的表达水平。结果表明,(1)3个TIFY基因含有TIFY结构域和Jas motif,属于JAZ蛋白亚家族基因;(2)3个TIFY基因的启动子含有LTR、DRE core、STRE、TC-rich repeats等逆境相关顺式作用元件以及MeJA(茉莉酸甲酯)响应元件、ABA(脱落酸)响应元件等激素响应相关元件,推测3个TIFY基因可以响应多种非生物胁迫;(3)Cs1g17220和Cs4g07130在果实中高表达,可能与果实发育相关;(4)在"龟井2501"中,3个TIFY基因受低温诱导在早期上调表达,且低温胁迫程度越大,其受诱导上调表达的倍数越高。本研究可为进一步解析TIFY基因家族在柑桔中的作用和功能提供重要线索。     

番木瓜CpWRI3参与调控果实成熟过程中脂肪酸合成

以番木瓜（Carica papaya L.）果实为研究材料，通过前期构建的果实成熟数字基因表达谱，克隆得到1个编码WRI家族调控因子的基因，命名为CpWRI3。氨基酸序列比对和进化分析发现CpWRI3与拟南芥AtWRI3/4同源性较高。转录因子活性分析表明，CpWRI3具有一定的转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明，CpWRI3的表达水平随着果实成熟不断升高，采后8 d达到峰值，表明其在果实成熟的后期发挥重要作用。在果实中瞬时过量表达CpWRI3促进了月桂酸、棕榈油酸和亚油酸含量的提升。体外凝胶阻滞试验（EMSA）证实CpWRI3能与下游靶基因Cp KAS1和Cp ACC1启动子上AW-box元件的序列特异结合。利用荧光素酶系统进一步证明CpWRI3可以在植物体内诱导CpKAS1和CpACC1启动子的表达。上述结果表明CpWRI3能参与调控月桂酸、棕榈油酸和亚油酸等脂肪酸合成。