柑橘体细胞胚发生基因CsHB1特异肽段多克隆抗体的制备及其蛋白动态检测

【目的】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达系统,制备多克隆抗体,并检测抗体在‘伏令夏橙’胚性愈伤体胚诱导阶段中的特异性,为研究CsHB1基因在柑橘体细胞胚发生过程中的功能奠定基础。【方法】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N,转化大肠杆菌诱导目的融合蛋白的表达,并制备获得多克隆抗体anti-CsHB1-N。通过Western blot检测抗体在原核表达系统和柑橘体细胞胚诱导阶段的特异性,并分析体细胞胚诱导阶段CsHB1蛋白水平表达的动态变化。【结果】重组原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N在Escherichia coli中高效表达出了分子质量约为49 ku的GST-CsHB1-N融合蛋白,并纯化获得多克隆抗体anti-CsHB1-N;经过Western blot分析表明,多克隆抗体可与‘伏令夏橙’愈伤体胚诱导阶段表达的目的蛋白特异结合;蛋白表达结果分析表明,在胚性愈伤组织中CsHB1蛋白呈现高的表达量,随着诱导培养的进行,呈现了先下降后上升的波动变化。【结论】多克隆抗体特异性好,可与‘伏令夏橙’胚性愈伤组织中目的蛋白特异性结合,可用于CsHB1基因功能分析。     

柑橘体细胞胚发生基因CsHB1特异肽段多克隆抗体的制备及其蛋白动态检测北大核心CSCD

【目的】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达系统,制备多克隆抗体,并检测抗体在‘伏令夏橙’胚性愈伤体胚诱导阶段中的特异性,为研究CsHB1基因在柑橘体细胞胚发生过程中的功能奠定基础。【方法】构建柑橘HD-ZIP II转录因子CsHB1基因的原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N,转化大肠杆菌诱导目的融合蛋白的表达,并制备获得多克隆抗体anti-CsHB1-N。通过Western blot检测抗体在原核表达系统和柑橘体细胞胚诱导阶段的特异性,并分析体细胞胚诱导阶段CsHB1蛋白水平表达的动态变化。【结果】重组原核表达载体p GEX4T-CsHB1-N在Escherichia coli中高效表达出了分子质量约为49 ku的GST-CsHB1-N融合蛋白,并纯化获得多克隆抗体anti-CsHB1-N;经过Western blot分析表明,多克隆抗体可与‘伏令夏橙’愈伤体胚诱导阶段表达的目的蛋白特异结合;蛋白表达结果分析表明,在胚性愈伤组织中CsHB1蛋白呈现高的表达量,随着诱导培养的进行,呈现了先下降后上升的波动变化。【结论】多克隆抗体特异性好,可与‘伏令夏橙’胚性愈伤组织中目的蛋白特异性结合,可用于CsHB1基因功能分析。     

茶儿茶素合成关键酶基因CsANS和CsLAR的功能鉴定

以‘英红9号’茶树[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]为材料,克隆了儿茶素合成途径的两个关键酶基因CsANS和CsLAR,并利用原核表达、亚细胞定位以及转基因表达分析对其功能进行鉴定。结果表明,CsANS和CsLAR开放阅读框（openreadingframe,ORF）分别长1068和1029bp,与TPIA数据库中来源于‘舒茶早’的对应基因同源性均高达99%。CsANS和CsLAR可溶性蛋白均能在原核表达系统诱导获得,并经GST标签成功纯化。本氏烟草叶片的瞬时表达结果显示,CsANS和CsLAR编码的蛋白定位于细胞质和细胞核。利用农杆菌介导的遗传转化方法在茶愈伤组织中超表达CsANS和CsLAR,结果显示其均能显著促进总儿茶素的合成,其中CsANS主要促进顺式儿茶素（EC和EGCG）含量的增加,而CsLAR主要促进反式儿茶素（C、GC、CG和GCG）的积累。推测在‘英红9号’茶树中CsANS的功能主要是促进顺式儿茶素的合成,而CsLAR更利于反式儿茶素的合成。     

苹果液泡膜蔗糖转运蛋白基因MdSUT4的表达分析与功能鉴定

以新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆1号’为试材,克隆MdSUT4并原核诱导获得其重组蛋白,对其进行生物信息学分析,测定其在不同组织及不同发育时期果实中的表达,通过亚细胞定位及转基因鉴定其功能。结果发现,MdSUT4编码的蛋白大小为55 kD左右,定位于8号染色体,由5个外显子和4个内含子组成;糖代谢相关基因系统进化树分析发现,MdSUT4与AtSUC4、PpSUT4在同一个进化支上;定量表达分析发现,MdSUT4在苹果的花、叶和幼果中均有较高的表达,且在果实发育中的表达水平与蔗糖含量显著负相关;MdSUT4启动子含有与糖信号及激素信号相关的顺式作用元件;在‘王林’苹果愈伤组织中过表达MdSUT4,能降低蔗糖含量,但却提高类黄酮含量;MdSUT4定位于‘王林’愈伤组织原生质体的液泡膜上。以上结果表明,MdSUT4可能参与了蔗糖从液泡膜中的外排,并可能促进类黄酮的合成。     

苹果MdDRB1的表达与功能分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica‘Royal Gala’)为试材,扩增Md DRB1基因,分析其序列结构,同时原核诱导Md DRB1蛋白并观察其亚细胞定位。利用q RT-PCR检测Md DRB1在非生物胁迫下的表达量,通过遗传转化苹果苗鉴定Md DRB1在非生物胁迫中的功能。基因结构分析显示,Md DRB1具有2个内含子和3个外显子。亚细胞定位显示,Md DRB1主要定位于细胞核,少数定位在细胞质。原核诱导结果显示,Md DRB1融合蛋白以包涵体的形式存在。同时发现Md DRB1反义转基因愈伤中与抗性相关的mi RNA的表达水平上调。在PEG、ABA、盐和低温处理的材料中Md DRB1的表达水平明显上调。另外,Md DRB1过量表达明显提高了转基因苹果组培苗的抗性。推测Md DRB1在抗逆胁迫响应中有重要作用。     

红肉苹果冷信号基因MdICE1的表达及其蛋白与MdMYB的互作

根据拟南芥AtICE1蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到苹果同源蛋白序列,利用DNAMAN软件设计特异性引物并克隆苹果冷信号基因（MDP0000662999）,暂命名为MdICE1。以从新疆红肉苹果与‘富士’杂交F1代中选出的‘紫红3号’叶片诱导出的红色愈伤组织为试材克隆MdICE1,测序发现该基因的开放阅读框长度为1 626 bp,编码541个氨基酸。进化树分析表明,MdICE1与AtICE1在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。氨基酸序列比对发现,MdICE1存在bHLH基序。低温处理有利于苹果愈伤组织花青苷的累积;与培养在24 ℃下的愈伤组织相比,低温（8 ℃）诱导苹果愈伤组织冷信号基因MdICE1以及花青苷合成相关转录因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表达。酵母双杂交试验证明MdICE1可以与MdMYB10相互作用;亚细胞定位发现MdICE1蛋白存在于细胞核内;转化大肠杆菌并诱导获得了MdICE1的重组蛋白,为进一步研究MdICE1蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

茶树CsAIL的克隆及在不同休眠阶段的表达分析

从茶树不同休眠状态腋芽转录组中筛选出一条差异表达基因,经全长克隆和同源性分析证实该基因为与多年生植物休眠的形成和解除密切相关的AINTEGUMEN-LIKE(AIL)的同源基因,命名为CsAIL。生物信息分析表明,该基因包含1个1 872 bp的开放阅读框,编码623个氨基酸。编码的蛋白质分子质量为69.2kD,理论等电点为6.6,是一种非分泌性蛋白;该蛋白有两个保守的AP2结构域,是植物中特有的广泛参与生长发育调节的AP2亚家族成员。亚细胞定位预测CsAIL蛋白不存在于叶绿体或者线粒体中,可能定位于其他细胞器;经同源性分析,在‘云抗十号’和‘舒茶早’全基因水平上分别鉴定了11个和12个AIL同源基因。系统进化树及序列保守性分析显示,Cs AIL与‘云抗十号’CSA001743.1和‘舒茶早’TEA027750.1的进化关系最近,与已知的拟南芥AIL蛋白处于不同分支,但具有典型的保守结构域和已知的重要氨基酸位点。启动子序列分析显示该基因可能受生理节律、光及多种激素等信号共同调控。CsAIL在茶树顶芽、腋芽和茎中的表达量较高,叶片中较低,花中几乎不表达。在茶树冬季类休眠和生理休眠阶段,该基因的表达量在叶和越冬芽中均逐渐下调并维持在较低水平;在生态休眠及萌动阶段显著上调。分析其可能的下游调控基因CsCYCD3.2和CsCYCD6.1的表达,二者与Cs AIL的表达模式高度一致,与越冬芽的休眠状态存在高度关联。本研究表明,CsAIL可能是参与茶树休眠调控的关键基因,与CsCYCDs共同在茶树年休眠—生长循环中发挥作用。     

红肉苹果愈伤组织生长素信号相关基因MdARF3的克隆与表达分析

以红肉苹果‘紫红3号’(新疆红肉苹果与‘富士’F_1代)的红色幼嫩叶片为外植体诱导的红色愈伤组织为试材,初步探讨生长素调控苹果花青苷代谢机理。根据拟南芥AtARF3蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到一个生长素信号相关基因(MDP0000173151),暂命名为MdARF3。克隆测序发现该基因的开放阅读框长度为2 127 bp,编码708个氨基酸。进化树分析表明,MdARF3与AtARF3在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。愈伤组织在含有0.3 mg·L~(-1) NAA的MS培养基培养2 h之后其MdARF3上调表达,表达量极显著高于无NAA培养基(对照),而CHS、CHI、F3H、DFR、UFGT及LDOX等花青苷合成结构基因的表达量均极显著低于对照,并且MdARF3表达量与培养基中NAA浓度呈显著正相关(相关系数为0.98),与愈伤组织花青苷含量呈显著负相关(相关系数为–0.89),推测MdARF3对培养基中生长素快速做出反应调控花青苷合成;通过原核诱导获得了MdARF3的重组蛋白,为进一步研究MdARF3蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

苹果MdNAC143的克隆及其在苹果愈伤组织的抗盐功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个NAC转录因子基因MdNAC143(序列号:MDP0000334047),其开放阅读框为924 bp,编码308个氨基酸,预测蛋白质的分子量为35.59 k D,等电点为6.32。结构域分析表明,MdNAC143蛋白N端含有保守的NAC结构域。酵母双杂交结果表明MdNAC143的全长及C端具有转录激活活性。荧光定量PCR分析表明,MdNAC143在苹果的各个组织均有表达,其中在叶片和花中表达相对较高;MdNAC143的表达明显受盐胁迫的诱导。将MdNAC143遗传转化‘王林’苹果愈伤组织,进行抗盐表型鉴定后发现,MdNAC143在愈伤组织中过量表达后能明显提高对盐胁迫的抗性。     

茶树DHAR酶基因的克隆与非生物胁迫响应分析

利用RT-PCR技术从茶树‘龙井43’cDNA中克隆得到1个编码茶树脱氢抗坏血酸还原酶基因CsDHAR，该基因全长639 bp，编码212个氨基酸，属于谷胱甘肽转移酶（GST）超级家族成员，具较高保守性。系统进化分析结果表明CsDHAR蛋白与拟南芥DHAR1、DHAR2进化关系近，在不同物种间，与毛果杨、胡杨等植物亲缘关系较近；理化性质分析表明CsDHAR属于亲水性蛋白；结构分析表明CsDHAR蛋白具典型功能结构域，三级结构主要由α–螺旋和不规则卷曲构成。荧光定量PCR分析显示，CsDHAR在茶树叶片不同发育阶段表达量差异不显著；对‘龙井43’与‘安吉白茶’中CsDHAR进行荧光定量PCR分析，‘龙井43’在低温、高温处理4 h表达量最高、干旱和高盐处理24 h表达量最高；‘安吉白茶’在高温、高盐处理4 h表达量最高，干旱处理2 h表达量最高。不同逆境胁迫下CsDHAR均被诱导表达，表明该基因参与茶树响应逆境胁迫调节过程。     

矮生山茶‘恨天高’GA20ox1的克隆及其对转基因烟草株形的影响

根据山茶（Camellia japonica）同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3′,5′-RACE技术,从云南山茶（C. reticulata）矮生品种‘恨天高’茎尖组织中克隆出GA20–氧化酶（GA20-oxidase,GA20ox）基因,命名为CrGA20ox1（GenBank登录号：KP635268）,基因全长1 178 bp,开放阅读框1 146 bp,编码381个氨基酸。实时荧光定量PCR分析发现,GA20ox1在4种不同的山茶中均得到表达,其中乔木类的浙江红山茶（C. chekiangoleosa）GA20ox1表达量最高,其次是岳麓连蕊茶（C. handelii）及金花茶（C. nitidissima）,表达量最低的为矮生品种‘恨天高’。结果表明该基因的表达量高低与测试物种的株高有关。GA20ox1在4个物种不同组织中的表达模式基本一致,且在茎尖组织中的表达量均高于叶片。CrGA20ox1转基因烟草分析结果表明,过表达CrGA20ox1烟草株高约为野生型的3.6倍,而沉默表达 CrGA20ox1烟草株高约为野生型的一半。     

早酥梨抗黑星病相关基因PbzsREMORIN的克隆及功能分析

 以高抗黑星病的早酥梨为试材,利用从梨抗黑星病抑制消减文库中筛选出病原菌诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆获得其全序列,命名为PbzsREMORIN（GenBank登录号为HQ901373）。该基因全长897 bp,开放阅读框（ORF）597 bp,编码198个氨基酸;生物信息学分析表明该基因具有remorin家族保守结构域;实时荧光定量RT-PCR结果表明,该基因受梨黑星病病原菌的诱导;用基因枪法将基因与GFP的融合蛋白转化到洋葱鳞茎表皮细胞中,瞬时表达显示remorin蛋白定位于细胞膜、细胞质和细胞核中;将目的基因转入烟草品种NC89,共获得27个转基因烟草株系;离体叶片接种烟草青枯病病原菌结果表明,过量表达该基因增强了NC89对烟草青枯病病原菌的抗性。该基因可能在植物与病原菌互作过程中起重要作用。     

百合APX基因的克隆及转LlAPX提高拟南芥耐盐性

从铁炮百合‘白天堂’（Lilium longiforum‘White Heaven’）组培苗叶片中克隆得到一个抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）的cDNA序列,全长1 074 bp,推断其编码251个氨基酸。系统进化树分析表明APX在进化过程中保守性很高。通过构建过表达载体,转化拟南芥,其APX酶活性提高了4.7 ~ 7.8倍,AsA含量提高了1.5 ~ 2.3倍,其种子耐盐性提高。     

苹果细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2的克隆及抗性鉴定

采用同源克隆和PCR技术从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆细胞分裂素氧化酶基因MdCKX7.2(基因序列号:MDP0000279125)。该基因含有1 542 bp的完整开放阅读框,编码513个氨基酸。利用Plant CARE数据库对MdCKX7.2启动子顺式作用元件进行预测分析,发现MdCKX7.2启动子序列中存在光、干旱、脱落酸、水杨酸、茉莉酸甲酯等响应元件。基因表达分析发现,‘嘎拉’幼苗中MdCKX7.2的表达明显受干旱和ABA的诱导。通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCKX7.2转基因拟南芥植株。抗性试验表明,异位表达MdCKX7.2基因明显提高了拟南芥对干旱胁迫的抗性。拟南芥种子萌发试验表明,在拟南芥中异位表达MdCKX7.2提高了植株对ABA的敏感性,种子萌发率和幼苗鲜质量明显下降,与种子萌发相关基因的表达量明显上调。以上试验结果表明,MdCKX7.2在植物非生物胁迫响应中发挥重要作用。     

‘元帅’苹果短枝变异逆转座子插入位点临近基因MdRDACO1的表达及功能分析

前期研究发现在‘元帅’苹果短枝突变体4号染色体约3 768 578 bp处存在一个2 190 bp的逆转座子Mdsolo-LTR1及其插入位点3'端约50 kb处有一乙烯合成限速酶基因ACO1。以‘元帅’及其短枝突变品种‘奥勒冈矮生’为试材，研究逆转座子Mdsolo-LTR1对其临近基因MdRDACO1表达活性的影响。荧光定量PCR结果表明，MdRDACO1的表达量在新梢发育至9节和12节时的顶芽和新梢半木质化前各阶段的茎段中均是‘元帅’显著高于‘奥勒冈矮生’。拟南芥异源转化结果显示，播种后7 d时，转MdRDACO1基因株系下胚轴长度和45 d时株高显著高于野生型和转空载株系；进一步分析发现，转MdRDACO1株系中古巴焦磷酸合成酶基因AtCPS1的表达量显著高于野生型和转空载株系。试验结果暗示‘奥勒冈矮生’等短枝突变体中，逆转座子Mdsolo-LTR1可能通过抑制其临近的乙烯合成限速酶基因MdRDACO1的表达活性，从而抑制受乙烯正调控的赤霉素合成关键基因MdCPS活性，进而导致短枝突变。     

STTM技术沉默马铃薯Stu-miR156对其侧根发育的影响

为了阐明Stu-miR156在马铃薯侧根发育中的生物学功能,以马铃薯栽培品种'Desiree'为试验材料,利用短串联靶标模拟物(Short tandem target mimic,STTM)技术,成功构建了Stu-miR 156沉默表达载体,通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转化植株,qRT-PCR技术检测Stu-miR...     

‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1的功能初步分析

以欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’为材料,利用同源克隆法获得1个NAC转录因子,命名为VvDRL1（GenBank：XP-002281816）。该基因全长840 bp,编码280个氨基酸,与‘黑比诺’葡萄中该基因的同源性为100%,但是基因组DNA序列中存在6处单核苷酸突变。瞬时转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位分析,VvDRL1基因主要在细胞核内表达,属于核蛋白;通过农杆菌介导的叶盘法获得稳定整合的转基因烟草,T2代转基因植株生长迟缓,株高、叶面积和叶片细胞面积约为野生型烟草的60%、34%和31%,转基因植株叶片出现向内卷曲现象,利用石蜡切片进行显微结构观察,转基因植株主叶脉上表皮下缺失2 ~ 3层厚壁细胞,且海绵组织内的空隙明显多于野生型植株。研究结果表明,VvDRL1在调控植株的形态发育方面起着重要作用。