中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。     

马铃薯S病毒PVSO株系RT-LAMP检测方法的建立及应用

为建立一种马铃薯S病毒普通株系PVSO快速、灵敏的RT-LAMP可视化检测方法。根据马铃薯S病毒普通株系的CP核苷酸序列设计4条引物,以感染PVS的马铃薯叶片总RNA为模板,采用一步法RT-LAMP,在62 ℃下反应60 min,扩增产物利用琼脂糖电泳分析和钙黄绿素染料显色判断结果,同时对其特异性和灵敏性进行测定。结果表明,建立的RT-LAMP方法可特异地对PVSO进行检测,检测灵敏度为RT-PCR的100倍。对33份马铃薯样品检测表明,RT-LAMP与RT-PCR方法检测结果基本一致。因此建立的PVSO的 RT-LAMP可视化检测方法简便,特异性强,灵敏度高,适合PVSO的快速检测。     

辣椒轻斑驳病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMo V）是发生在辣椒上的一种重要病毒病。通过逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）,以PMMo V外壳蛋白CP序列为靶标基因,设计F3/B3、FIP/BIP 4条引物,构建了基于RT-LAMP技术的PMMo V快速检测方法。结果表明,该方法在60 min内便可完成对PMMo V的特异性检测,灵敏度比传统RT-PCR技术高10倍,检测过程中与其他相关病毒无交叉反应。本试验建立的PMMo V RT-LAMP检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高,可用于田间生产中对PMMo V的快速检测。     

柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立

柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

利用NASBA技术检测草莓斑驳病毒

依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence based amplification,NASBA)技术是以cDNA为中介体在等温条件下直接扩增单链RNA特异序列的核酸扩增技术,研究探索利用NASBA技术检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)。在对14个SMoV分离物序列分析的基础上,设计和筛选出适于SMoV检测的NASBA引物。NASBA检测SMoV的适宜反应温度为40℃。在9份草莓样品上检测SMoV的结果显示,NASBA检测结果与RT-PCR的检测结果一致,这表明初步建立了利用NASBA技术检测SMoV的技术体系。这是利用NASBA检测SMoV的首次报道。     

柑桔黄龙病LAMP快速检测方法的建立

根据GenBank中柑桔黄龙病菌的外膜蛋白(OMP)基因序列,设计了一套环介导等温扩增引物,建立了柑桔黄龙病的环介导等温扩增检测方法.该方法灵敏度可达25 pg/μL,与实时荧光PCR方法灵敏度相同.全部反应只需一个可控温的水浴锅在60分钟内即可完成,通过肉眼观察浊度状况即可判定结果.该方法具有简便、快速、灵敏、特异等特点,适用于基层工作站的柑桔黄龙病鉴定工作.     

草莓斑驳病毒的RT-PCR技术检测

针对草莓斑驳病毒(SMV)基因组外壳蛋白保守序列设计特异引物,利用改进的CTAB法提取出优质的草莓斑驳病毒的总RNA,然后进行RT-PCR分子检测以期建立草莓斑驳病毒的RT-PCR检测体系。结果表明:RNA质量完好,证明改进的CTAB法应用于草莓总RNA的提取是切实可行的。     

利用RT-PCR技术检测辣椒轻斑驳病毒的研究

在田间病害调查过程中发现的一批感染病毒病的辣椒样本,经摩擦接种技术将病毒接种于烟草叶片,以期进行病毒鉴定.结果表明:经摩擦接种后烟草叶片显示斑驳、花叶症状;采用CTAB法提取辣椒及烟草叶片总RNA,利用RT-PCR技术,以辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMo V)特异引物,扩增出了预期大小片段,经测序证明其为PMMoV特异片段.     

广东辣椒上首次检测到西瓜银斑驳病毒

2014 年在广东辣椒产区发现疑似番茄斑萎病毒属（Tospovirus）病毒侵染引起的辣椒褪绿坏死环斑症状。Dot-ELISA 检测显示,该病毒分离物与番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）单克隆抗体不产生血清学反应,表明该病毒不属于TSWV。利用Tospovirus 属病毒通用引物gL3637/gL4435C进行RT-PCR 检测,可以从所有辣椒病样总RNA 中扩增出预期大小约800 bp 的目的片段。基因克隆与序列分析表明,该片段序列与西瓜银斑驳病毒（Watermelon silver mottle virus,WSMoV）中国广州分离物的同源性最高,为97.5%。系统进化分析也显示,该病毒分离物与WSMoV 各分离物亲缘关系最近,并聚类在一个分支。因此,侵染广东辣椒的病毒分离物为WSMoV。     

柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立

根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。     

柑橘黄化脉明病毒和衰退病毒的二重RT-PCR检测体系的建立与应用

选用柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)和柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)两种病毒外壳蛋白保守序列及内参基因Ubiquitin的特异性引物,优化影响二重RT-PCR反应的Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度和退火温度,建立了针对两种病毒的一步法二重RT-PCR检测体系。二重RT-PCR获得CYVCV、CTV及Ubiquitin的特异性片段大小分别为614、373和194 bp,克隆测序和序列对比结果显示它们与已报道的病毒序列具有较高的同源性。该体系最低能从40 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CYVCV,从4 ng·μL~(-1)总核酸中检测出CTV,其灵敏度与单一RT-PCR检测灵敏度一致。利用该体系对33份田间样品进行检测,CYVCV和CTV感染率分别为54.5%和66.7%,复合侵染率高达36.4%。该一步法二重RT-PCR技术体系可用于大量田间样品中CYVCV和CTV的快速同步检测。     

柑橘叶脉开裂症与矿质营养的关系

 柑橘叶脉开裂症属于多病因的病症,缺Mg或缺B均可导致发病。对‘纽荷尔’脐橙[Citrus sinensis（L.）Osbeck‘Newhall’]的缺Mg叶脉开裂症病株,在生长季4月采用1.0%硝酸镁叶面喷施矫治2 ~ 3次,可有效降低病叶发生。通过福建柑橘产区普查,由缺Mg引起叶脉开裂症占86.2%,其次为B与Mg共同缺乏,缺B仅占2.3%。不同品种缺Mg叶脉开裂的感病顺序为：纽荷尔脐橙＞琯溪蜜柚,其它发病品种还有金柑、早熟温州蜜柑、瓯柑。采用易感品种纽荷尔脐橙与抗性品种椪柑互为中间砧高接比对发现,纽荷尔脐橙对Mg和B的吸收能力低于椪柑,对K的吸收高于椪柑,这可能是纽荷尔脐橙易患叶脉开裂症的原因。缺Mg和缺B病症的最显著的区别为,缺Mg叶脉开裂多位于叶片顶部“∧”形黄化部位;缺B叶脉开裂症病叶呈绿色不黄化;Mg、B缺乏症的病叶主脉和侧脉明显开裂与全叶黄化,或叶脉开裂达基部“∧”形绿色区域。     

柑橘病毒类病害诊断技术研究进展

柑橘病毒类病害对世界柑橘产业造成了严重的损失。诊断技术是防控柑橘病毒类病害的重要保障。对指示植物鉴定、电镜技术、血清学方法、核酸杂交、（RT-）PCR以及新近出现的环介导恒温扩增、基因芯片和高通量测序等技术在柑橘病毒类病害诊断中所取得的进展进行综述,并对今后的发展方向进行了展望,旨在为更好地防治柑橘病毒类病害提供借鉴。     

浙江南部柑桔病毒病和类似病毒病鉴定

应用指示植物对采自浙南8个县(市、区)28个乡镇田间40个柑桔品种133份样品的带毒情况进行了检测。结果表明:浙南至少已发生4种柑桔病毒病或类似病毒病害。感染了碎叶病毒(TLV)的有8个品种,衰退病毒(CTV)18个品种,裂皮病类病毒(CEV)11个品种,黄龙病类细菌(CYS)2个品种。共计有27个品种感染1种或1种以上病毒类病害,其中感染3种的有2个品种,感染2种的有9个品种。     

柑桔春梢疮痂病预报模型的建立及应用验证

本文以历年的气象资料和发病记录为依据，用相关分析和多元回归的方法，建立起了柑桔春梢疮痂病的长期和中期预报模型：Y1=75.2 1.6T^-12f-6.5(T^-12m∨T^-121)-1.3T^-12m-0.5T^-121；Ym=68.3 1.5T^-12f-6.5(T^-12m∨T^-121)-2.7|T^-3f-7.1|这两个预报模型的历史拟合率均达100%，经4年的应用验证，结果均与实际相符。     

环割对柑橘叶片衰老的影响

以3年生红黎檬砧‘暗柳橙’（Anliucheng）为试材,研究了环割与环剥对柑橘叶片光合性能及活性氧代谢的影响。结果表明,环割和环剥30 d后均不同程度降低了叶片叶绿素相对含量（SPAD）、净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）、气孔导度（Gs）和细胞间CO2浓度（Ci）,其中环剥处理对叶片SPAD和Pn产生了持续性的影响;环割和环剥在处理的前期均显著增加了叶片超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶活性;处理30 d后叶片抗氧化物质抗坏血酸（AsA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量显著低于对照,随后呈上升趋势,达到一个峰值后缓慢恢复到正常状态;各处理叶片膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量均呈上升趋势,环割2次和环剥处理叶片初期MDA含量显著高于对照,引发柑橘叶片中一系列抗氧化反应,造成其膜脂氧化程度加剧。