山葡萄转录因子VaMYB4a互作蛋白的筛选与鉴定

以抗寒种质山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)‘左山–1’叶片组织为试材，通过Gateway技术构建酵母均一化cDNA文库，库容量为1.36×10⁷ cfu·mL^-1，外源基因插入片段均大于1 kb，重组率为100%，符合后续试验要求。以VaMYB4a^113-252C端调控区段为诱饵，经酵母双杂交筛选获得17个候选互作蛋白，选取2个与非生物胁迫应答密切相关的候选互作蛋白分别在酵母、拟南芥原生质体中进行互作验证，发现锌指类转录因子VaCOL4、VaCOL5均与VaMYB4a全长及VaMYB4a^113-252存在互作关系。经系统进化与蛋白保守结构域分析，推测葡萄COL基因家族中VaCOL2与VaMYB4a具有潜在互作关系，进而通过BiFC验证表明，VaCOL2与VaMYB4发生蛋白互作；顺式作用元件预测表明VvCOL2、VvCOL4与VvCOL5启动子区包含多个激素及逆境应答相关元件，其中VvCOL2包括多个低温响应元件(LTRE)；低温胁迫下，VaMYB4a、VaCOL4与VaCOL5...     

欧洲葡萄VvJAZ9基因互作蛋白的筛选与验证

【目的】探究葡萄JAZ家族基因特点及在低温胁迫下的表达情况，以期筛选出与低温胁迫相关的家族成员，并进一步筛选其互作蛋白，为后续葡萄抗寒机制研究提供理论依据。【方法】以拟南芥和葡萄基因组数据为基础，获得葡萄JAZ家族成员基因并进行同源克隆、染色体定位、理化性质以及蛋白家族聚类等分析，利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术分析VvJAZ家族成员基因在低温胁迫下的表达情况，应用酵母双杂交技术进行互作蛋白筛选和验证，并通过双分子荧光互补试验验证候选互作蛋白与VvJAZ9蛋白的互作关系。【结果】葡萄中有11个JAZ家族基因，随机分布于7条染色体上，都具有JAZ家族蛋白中特有且高度保守的TIFY和Jas结构域，均属于碱性不稳定亲水蛋白；聚类分析表明，葡萄JAZ家族蛋白可分为3个亚族，其中VvJAZ9与拟南芥AtJAZ1和AtJAZ2的亲缘关系最近，VvJAZ1与VvJAZ11、VvJAZ5与VvJAZ6同源关系最近。qRT-PCR结果表明，VvJAZ9是葡萄JAZ家族成员基因中受低温诱导表达最为明显的1个基因。通过酵母双杂交试验筛选获得2...     

月季RhNAC31互作蛋白的筛选及分析

为了进一步研究RhNAC31在胁迫响应中的作用机制,以RhNAC31蛋白为诱饵,利用酵母双杂交系统在切花月季‘萨曼莎’失水胁迫cDNA文库中进行了互作蛋白的筛选和分析。根据RhNAC31的转录激活区域(C端,157～286 aa)的序列特征,将其划分为C1(157～250 aa,RhNAC31-C1)和C2(251～286 aa,RhNAC31-C2)两段,分别构建到pGBKT7上检测其自激活活性及对酵母Y2H Gold细胞的毒性。结果显示,pGBKT7-RhNAC31-C1和pGBKT7-RhNAC31-C2对酵母Y2H Gold细胞均没有毒性,能激发金担子素A(Aureobasidin A,AbA)报告基因的表达,具有自激活活性,在含有400 ng·mL-1 Ab A的SD缺陷型培养基上其活性受到抑制,以含该浓度AbA的培养基作为筛选文库培养基。在此筛选条件下,在酵母双杂交文库中筛选到21个阳性克隆,对其测序并用Blast比对获得了16个与RhNAC31互作的候选蛋白。利用Uniprot网站对互作蛋白进行基因本体学分析,结果显示RhNAC31能够与RZFP34、MIEL1、RUB泛...     

沪农系列灵芝新品种活性成分及免疫活性对比研究

以相同条件下栽培获得的沪农系列7个不同品种的灵芝(Ganoderma lucidum)子实体作为研究材料，分析比较其总多糖、核苷、三萜和糖醇的含量、多糖重均分子量分布特征差异以及刺激RAW 264.7巨噬细胞释放NO的活性。结果表明：不同品种灵芝总多糖含量在1.15%～5.11%之间，含量较高的3个品种由高到低为‘沪农芝7号’(5.11%)、‘沪农芝8号’(2.36%)、‘沪农灵芝4号’(2.07%)。不同灵芝品种粗多糖分子量分布存在差异，‘沪农灵芝4号’主要含有重均分子量为3.38×10⁶、4.24×10⁶、4.38×10³g·mol^-1的三个多糖组分，‘沪农灵芝1号’主要含有重均分子量为1.01×10⁷和8.03×10³g·mol^-1的两类多糖组分，‘沪农芝7号’主要含有重均分子量为4.50×10⁵、6.20×10³ g·mol^-1的两个多糖组分，其余4个品种均含有...     

白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)BcMAX2调控腋芽生长的功能分析

MAX2(MORE AXILLARY GROWTH 2)是独脚金内酯信号转导相关基因，其功能与腋芽生长有关。以白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）分蘖菜品种‘马耳头’和普通白菜品种‘苏州青’为材料，探究MAX2对腋芽生长的影响。结果表明：从两种材料中克隆得到的BcMAX2其开放阅读框序列没有差异，‘马耳头’的BcMAX2启动子序列有2个碱基的缺失。亚细胞定位分析表明BcMAX2定位在细胞核。在拟南芥中过表达BcMAX2抑制腋芽生长，BRC1表达量升高。在‘马耳头’中沉默BcMAX2能引起BcBRC1表达量降低并促进腋芽伸长。通过对白菜cDNA文库筛选得到197个与BcMAX2互作的候选蛋白，其中多数候选互作蛋白具有结合活性和催化活性，部分候选蛋白还参与植物的信号转导和逆境响应。通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证最终得到2个与BcMAX2互作的蛋白。试验表明，白菜BcMAX2可能通过促进BcBRC1的表达来负调控腋芽的生长。     

酿造干红葡萄酒新品种‘左优红’

1979年采用山葡萄雌能花品种‘左山二’作母本与‘小红玫瑰’(欧亚种酿酒葡萄)进行种间杂交,从杂交一代中选育出低酸、高糖优良单株‘79-26-18’。1987年用‘79-26-18’作母本与山葡萄低酸、高糖两性花品系‘74-13-26’‘(73134’ב双庆’)杂交,从后代中选育出的酿造干红山葡     

感染青枯病病原菌R.solanacearum的茄子酵母双杂交文库构建及评价

以高抗青枯病的茄子高代自交系‘Q31-1’为试材,采用同源重组法构建了感染青枯病原菌R.solanacearum的茄子根部酵母双杂交cDNA文库,以期为研究茄子(Solanum melongena L.)与青枯病病原菌R.solanacearum的互作机制奠定基础。结果表明:文库库容大于1.25×10~7 CFU,平均插入片段大于1.5kb,随机挑选24个单克隆进行PCR检测,阳性率为100%。表明该文库可用于进行下一步互作蛋白筛选的研究。     

山葡萄‘双丰’和‘左优红’叶绿素荧光特性及活性氧代谢与低温伤害的关系

为探明山葡萄叶片低温伤害的生理机制,以抗寒性差异明显的‘双丰’(山葡萄种内杂交种)和‘左优红’(种间杂交种)为试材,对低温处理过程中叶绿素荧光参数和活性氧代谢的相关指标进行测定。结果表明,随低温胁迫加剧,两个品种叶片的叶绿素含量、Chl.a/b、Fv/Fm值均呈显著下降趋势,1–qp值及MDA含量明显增加;整个胁迫过程中NPQ值较稳定的‘双丰’其叶片遭受低温伤害程度较轻,NPQ值一直下降的‘左优红’叶片伤害程度较重,‘双丰’的NPQ值始终显著高于‘左优红’。‘双丰’叶片的SOD和APX活性始终较‘左优红’高。说明低温使山葡萄叶片叶绿素分解,PSⅡ电子传递受阻,激发能增加,造成叶绿体膜脂过氧化损伤;热耗散及抗氧化酶共同作用减轻了活性氧对叶片PSⅡ的伤害程度。由此可见,热耗散NPQ值及活性氧清除酶SOD和APX活性的差异可能是造成两个山葡萄品种叶片低温伤害程度不同的重要原因。     

葡萄LIM家族基因特征及表达模式分析

为了明确LIM家族基因在葡萄非生物胁迫下的表达特性,在生物信息分析的基础上,以‘黑比诺’葡萄(Vitis vinifera‘Pinot Noir’)试管苗为试验材料,利用q RT-PCR技术检测了不同逆境处理对葡萄LIM家族基因成员表达的影响。结果显示,葡萄LIM基因家族有14个成员,可分为4个亚族,各亚族编码蛋白氨基酸数量差异较大,但亚族内差异较小;分析葡萄基因和拟南芥基因间的选择压发现,二者存在钝化选择关系;多序列比对发现,该家族基因成员含有1或2个锌指结构的保守结构域;保守基序分析结果表明,所有基因均包含motif2;基因结构显示Vv LIM含有4～15个外显子;14个基因中有11个编码蛋白存在互作关系。该家族基因存在大量的光诱导元件和水杨酸等逆境胁迫相关元件。基因芯片表达数据表明,高表达的基因主要存在生长旺盛的组织中。q RT-PCR分析发现,Vv LIM1在100 mmol·L^-1NaCl、10%PEG和50 mg·L^-1 SA胁迫下表达量与对照相比显著上调,且随处理时间的延长表达量显著增加。     

芥菜AGL18家族成员与开花整合子SOC1的互作分析

为阐明芥菜开花抑制因子AGL18与开花整合子SOC1间的互作调控机制,在芥菜‘QJ’的开花期克隆了AGL18-1,幼苗期克隆了AGL18-2和AGL18-3,它们分别编码257、257和258个氨基酸,为AGL18家族的3个成员。序列比对表明,芥菜AGL18家族成员与十字花科芜菁和油菜同源性均高达90%。酵母双杂交和BiFC试验表明:芥菜AGL18-1、AGL18-2和AGL18-3蛋白与SOC1不会发生蛋白相互作用。酵母单杂交和Dual-Glo~ Luciferase试验表明:AGL18-1、AGL18-2和AGL18-3中仅有花期AGL18-1蛋白与SOC1启动子间存在互作。为进一步筛选AGL18-1/SOC1的互作区域,分别截取了AGL18-1蛋白的M域和IKC域,发现仅M域与SOC1启动子存在相互作用,说明M域是介导花期AGL18-1蛋白与SOC1启动子互作的关键区域。这为深入研究AGL18与SOC1互作的分子机制及其对开花时间的调控奠定了基础。     

西瓜cDNA 表达文库构建及镰刀菌致病因子FonSIX6 互作蛋白的筛选和鉴定

 尖孢镰刀菌在与寄主的相互作用中分泌几个特定的富含半胱氨酸的小分子量蛋白（15.8 ~ 29.9 kD）进入木质部中启动致病力,被称为SIX（Secreted in xylem）蛋白。其中,SIX6蛋白是一个致病因子。西瓜专化型尖孢镰刀菌Fon（Fusarium oxysporum f. sp. niveurn）是引起西瓜枯萎病的病原真菌。为了解与FonSIX6存在相互作用的西瓜蛋白及其信号传导途径,克隆了FonSIX6基因,将FonSIX6的编码区与酵母GAL4的DNA结合功能区融合,构建成酵母诱饵蛋白表达载体pGBKT7-SIX6,进而转化到酵母菌株Y2H Gold中,经检测证实不具有毒性和自激活功能,可以用于酵母双杂交研究。同时,以国际上公认的抗枯萎病材料PI296341-FR构建酵母表达文库。采用酵母双杂交的方法,筛选到14个相互作用靶蛋白。分析筛选到的蛋白主要参与寄主的能量代谢、光合作用和基因表达调控,推测FonSIX6作用的靶位点主要是破坏寄主能量系统并影响光合作用,而寄主对其响应的方式是调控抗病基因的表达。     

甘蓝花粉管钙感应蛋白CaM 与SRK 相互作用研究

 为研究甘蓝花粉管钙感应蛋白CaM 与SRK 相互作用的分子机理及其可能相互作用的区域, 从自交不亲和甘蓝材料‘E1’中分别克隆得到CaM12 基因450 bp 及S 位点受体激酶（SRK7）基因全长 序列2 118 bp,并亚克隆得到SRK 胞外域（eSRK）和胞内激酶域（iSRK）,构建原核表达载体pGEX-CaM12、 pCold-eSRK 和pCold-iSRK,转化E. coli BL21（DE3）进行原核表达,表达产物纯化后进行体外相互作用, 结果表明CaM12 能够与SRK7 进行相互作用,但作用区域是iSRK7 而不是eSRK7。为进一步验证其相互 作用,本研究利用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-CaM12、pGADT7-eSRK7、pGADT7-iSRK7 和 pGADT7-SRK7 酵母表达载体,转化相应酵母Y2HGold 和Y187 感受态细胞后未出现自激活和毒性现象, 相互作用结果与原核表达检测一致。同时将CaM12 的3 个EF-hands 结构域突变体CaM12-2-、CaM12-23- 和CaM12-234-与iSRK7 分别构建酵母表达载体pGADT7-CAM12-2-、pGADT7-CAM12-23-、pGADT7- CAM12-234-,检测其相互作用。结果表明CaM12 EF-hands 突变体CaM12-2-、CaM12-23-和CaM12-234- 在酵母双杂交系统中均不能与iSRK7 片段发生相互作用,说明CaM12 的EF-hands 结构域突变后失去结 合Ca2+能力而不能与iSRK7 相互作用。该研究可为自交不亲和机理提供新的参考依据。 关键     

The discovery of the interaction between augmenter of liver regeneration and Na+, K+-ATPase with yeast two-hybrid system

AIM:To screen the proteins interacting with human augmenter of liver regeneration (hALR) by yeast two-hybrid system and to study the mechanism of hALR action. METHODS:hALR bait plasmid was constructed by ligating the gene of hALR into pGBKT7, then transformed into yeast AH109. The yeast strain AH109 containing pGBKT7-hALR was mated with yeast Y187 containing human liver cDNA library plasmid. Diploid yeast was plated on SD/-trp-leu-his-ade (QDO) for screening and on QDO containing X-α-gal for further selection.The AD/library inserts were amplified by PCR and the PCR products were characterized by digesting with Sau3AⅠ and HaeⅢ restriction enzyme to eliminate the duplicates. After sequencing, the positive clones were analysed by bioinformatics. RESULTS:Several positive clones were obtaind. The sequencing and analysis shown that one of them is 669 bp DNA fragment encoding β subunit of Na⁺, K⁺-ATPase. The 224 bp 3'terminal DNA fragment is non-encoder region, and the 445 bp 5'terminal DNA encodes C-terminal 147 amino acid residues of Na⁺, K⁺-ATPase β subunit. CONCLUSION:The results of screening proteins using yeast two-hybrid system showed that hALR could interact directly with Na⁺, K⁺-ATPase in the yeast cell.     

ATPase inhibitory factor 1-a host cell protein molecule interacting with human cytomegalovirus pUL23 protein

AIM: pUL23, the product of human cytomegalovirus (HCMV) gene UL23 was identified as one of tegument proteins. The aim of this research is to investigate the function of pUL23 during HCMV life cycle.METHODS: GAL4 yeast two-hybrid assay was performed to screen the human fetal kidney cDNA library to obtain host cell protein molecules which interact with pUL23 of HCMV. Then the GST-pulldown experiment was applied to confirm the protein interactions identified by yeast two-hybrid.RESULTS: ATPase inhibitory factor 1 (ATIF1) was selected from host cells using yeast two-hybrid assay. GST-pulldown experiments in vitro further confirmed the interaction between ATIF1 and pUL23.CONCLUSION: pUL23 of HCMV can interact with ATIF1 in host cell, which may provide the evidence for understanding the function of pUL23 in the life cycle of HCMV.     

Recognition of Homo sapiens cyclin H and avian infectious bronchitis virus by leucine rich repeat domain of NALP3

AIM：To investigate the proteins that interact with the domain of leucine-rich repeats in NALP3 (NALP3-LRR). METHODS：The DNA sequence of NALP3-LRR domain was cloned and verified by DNA sequencing. Using yeast two-hybrid system, the plasmid of NALP3-LRR-pSos as bait was constructed to screen the cDNA library of human embryonic lung. The positive clones were verified and selected by the method of yeast backcross verification. Co-immunoprecipitation assay was also performed to further confirm the reliability of the interactions of NALP3-LRR with the positive proteins. RESULTS：DNA sequence of NALP3-LRR domain was successfully cloned. Four positive clones interacted with NALP3-LRR domain were verified by the yeast two-hybrid screening from the cDNA library of human embryonic lung, in which Homo sapiens cyclin H and avian infectious bronchitis virus strain Cal99 ORF1a were further confirmed by the assay of co-immunoprecipitation. CONCLUSION：NALP3-LRR domain interacts with the proteins of Homo sapiens cyclin H and avian infectious bronchitis virus.     

辣椒PAP3和PPI蛋白相互作用的鉴定

PAP3(Gen Bank登录号:HM104635)和PPI(Gen Bank登录号:GU812176)基因是控制辣椒花器官发育的B类基因,共同控制花瓣和雄蕊的发育,均属于MADS-box家族基因。为验证PAP3蛋白和PPI蛋白的相互作用,利用酵母双杂交系统,构建pGBKT7-PPI和pGADT7-PAP3酵母表达载体,转化相应酵母AH109感受态细胞后未出现自激活和毒性现象,融合的二倍体酵母(pGBKT7-PPI×pGADT7-PAP3)能在营养缺陷型培养基上生长;同时利用体外GST-Pull down技术,将诱导的GST-PAP3蛋白和His-PPI蛋白孵育,结果均表明,PAP3蛋白和PPI蛋白之间存在特异性相互作用。     

BrVIN3.1 互作蛋白BrZAT12 在大白菜春化途径中行使功能初探

BrVIN3.1 在春化过程中通过调控BrFLC1 的表观修饰状态，进而调控其表达控制大白菜花期。本试验以BrVIN3.1 （Bra020445）为诱饵，进行酵母cDNA 文库筛选，从中筛选到它的互作蛋白BrZAT12（Bra006691）；进一步进行酵母双 杂一对一验证，证明BrZAT12 能够与BrVIN3.1 互作。采用低温处理不同花期的大白菜材料，进行表达模式分析，发现 BrZAT12 的表达模式在抽薹性状不同的大白菜材料中存在差异，在易抽薹材料中的表达量明显高于耐抽薹材料，且在耐抽薹 材料中变化幅度较小，同时BrZAT12 的表达模式与BrVIN3.1 相关。推测BrZAT12 可能在大白菜春化调控的开花途径中行使 功能。