BnA7HSP70分子伴侣结合蛋白超表达能够提高甘蓝型油菜耐旱性

分子伴侣结合蛋白广泛参与植物生长发育过程, 在逆境下能够保护植物细胞免受胁迫。在甘蓝型油菜中超表达油菜含有HSP70热激蛋白结构域的分子伴侣基因BnA7HSP70, 所得到的转基因植株在缺水条件下延缓萎蔫。通过生理生化实验证明, 干旱条件下转基因植株有着更高的相对含水量、更强的渗透调节能力和较低的脂质膜过氧化性。另外, 转基因植株的幼苗在萌发期表现出对糖基化酶抑制剂衣霉素处理的耐受性。Evans blue染色实验证明, 转基因植株逆境下叶片死亡细胞数目比非转基因植株减少, 叶片衰老相关标记基因BnCNX1在转基因植株中下调表达证明, 超表达BnA7HSP70基因所介导的途径能够减轻逆境胁迫下的植株衰老, 保持叶片持绿性。在转基因植株中内质网和渗透胁迫产生的细胞死亡标记基因N-Rich蛋白BnNRP延迟表达证明, 在油菜中增强BnA7HSP70基因的表达能够缓解未折叠蛋白途径(unfold protein response, UPR)和NRP (N-rich pathway)途径介导的叶片黄萎, 并降低油菜叶片失绿的标记基因BnLSC222和BnLSC54的表达。研究结果表明, 在油菜中超表达BnA7HSP70基因能够提高植株在干旱条件下内质网胁迫的耐受性。     

甜菜抗非生物胁迫研究进展

本研究主要从旱涝、盐碱、高低温以及土壤重金属污染4方面综述了非生物胁迫对甜菜生长发育、生理生化及分子水平的影响。研究发现甜菜在非生物胁迫下净光合速率下降,渗透调节物质浓度改变,活性氧代谢物质含量产生变化,生长发育受到影响;甜菜抗水分胁迫基因包括PSC5、PSCR、2-cysprx、NADK、cprx1、AVP1、Bv-txas等,MYB转录因子和NAC转录因子也在非生物胁迫中起重要作用;甜菜M14品系具有抗旱、耐盐等优良特性。WRKY家族转录因子、BvM14-Tpx、BvM14-CCoAOMT等基因、过氧化酶BvpAPX及各类盐应答蛋白质在抵抗盐胁迫中起促进作用;甜菜抗高低温研究较少,研究表明低温胁迫产生了甜菜抽薹基因的差异表达,甜菜SbSEC14基因在逆境条件下起到信号传导的功能;甜菜抗重金属胁迫研究进展近些年发展迅速,BvGS、BvMTP11、BvHIPP24、BvGST基因陆续被克隆。本研究提出今后应进一步加强甜菜抗非生物胁迫机制及应用的挖掘与创新;充分挖掘野生种中DREB基因,通过转基因技术培育抗逆性强的甜菜品种（系）;在单一逆境研究基础上,进一步开展多逆境条件下的抗逆研究;在生产上应用外源调控物、抗氧化剂、硅等抵御非生物胁迫对甜菜的生长发育影响。     

nsLTPs基因参与植物逆境胁迫应答的研究进展

编码非特异性脂质转移蛋白的基因nsLTPs在植物应答生物和非生物胁迫以及植物的生长发育中起到重要作用。为了研究植物nsLTPs基因响应生物及非生物胁迫的分子机制,本文归纳了非特异性脂质转移蛋白nsLTPs的结构特点及分类,分析了nsLTPs的亚细胞定位情况,并重点总结了nsLTPs基因在植物逆境胁迫应答方面的相关研究进展,提出了植物不同物种中nsLTPs基因参与植物逆境胁迫的分子调控途径,为完善nsLTPs基因参与植物逆境胁迫应答调控机制提供理论基础。     

甜菜M14品系BvM14-Tpx基因克隆及原核表达体系下应答氧化胁迫功能的初步研究

为了研究甜菜M14品系BvM14-Tpx基因的抗氧化功能,本试验以带有野生白花甜菜第9号染色体的单体附加系M14品系为试验材料,利用RACE技术获得甜菜M14品系硫氧还蛋白过氧化物酶基因(BvM14-Tpx) cDNA全长,对其进行生物信息学分析,利用Real-time PCR和半定量RT-PCR技术对该基因进行组织特异性表达分析,在原核表达体系下进行BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫研究。生物信息学分析结果表明,BvM14-Tpx基因cDNA全长为1044 bp,包含最大的ORF为489 bp,编码162个氨基酸;含有过氧化物酶Ⅱ(PrxⅡ)型的保守结构域;BvM14-Tpx蛋白与豌豆(Pisum sativum L.)和苜蓿(Medicago truncatula L.)中Tpx蛋白的亲缘性较高。组织特异性表达分析结果表明,BvM14-Tpx基因在甜菜M14品系各组织表达量从高到低的顺序是根、茎、叶、花。通过原核表达体系下BvM14-Tpx基因应答氧化胁迫的研究,表明BvM14-Tpx基因能够提高大肠杆菌对于环境中氧化胁迫的适应能力,减轻H₂O₂对细菌生长的抑制。本研究对挖掘甜菜M14品系优质基因,提高甜菜对于非生物胁迫的抗性以及开展甜菜遗传改良工作具有重要意义。     

能源甜菜BvHIPP24基因的特性及在酵母中的镉耐受功能分析

为了进一步研究重金属相关异戊二烯化植物蛋白在重金属逆境下的解毒机制,本研究克隆了能源甜菜BvHIPP24基因并分析了其在镉逆境下酵母中的功能。本研究以能源甜菜为实验材料,利用RT-PCR的方法克隆获得能源甜菜BvHIPP24基因,并对BvHIPP24基因进行生物信息学分析;利用酵母表达载体构建pYES2-BvHIPP24重组质粒并转化到酵母InVSc1,在真核酵母细胞中进行BvHIPP24基因应答镉胁迫的研究。生物信息学分析显示BvHIPP24基因的CDS全长444 bp,编码147个氨基酸,氨基酸序列的分子量为16377.34 Da,理论等电点为9.39,为亲水蛋白,不含有跨膜区域,定位于叶绿体。保守结构域分析该基因具有一个HMA结构域。构建进化树分析表明,能源甜菜BvHIPP24蛋白与BvHIPP23蛋白质具有较近的亲缘关系。当施加0.5 mmol/L CdCl₂胁迫后,适量表达BvHIPP24的重组菌与对照菌株相比,其生长趋势明显优于后者,并发挥着相对更高的Cd耐受性。这说明,能源甜菜BvHIPP24基因在镉逆境胁迫下发挥着重要的解毒作用,并有可能直接或间接参与细胞重金属离子吸收、转运及代谢平衡等过程。     

甜菜幼苗对干旱胁迫的适应机制

为了研究甜菜幼苗在干旱逆境耐受过程中的应答机制,本研究以‘780016B/12优’为目的材料,通过设置不同浓度（3%、6%,9%以及15%）的PEG6000干旱胁迫来处理甜菜幼苗,并进行恢复生长,来衡量不同干旱胁迫处理间甜菜的相关生理生化指标和目的基因的表达量变化。研究结果表明,逆境胁迫24 h后,随着干旱强度的增加,甜菜幼苗植株的皱缩和萎蔫程度也逐渐严重,并伴随着叶片相对含水量(3.48%~15.86%)以及叶绿素含量(5.60~13.06)的下降;而体内的丙二醛和脯氨酸却大量累积,其中以15% PEG增加的尤为明显,分别高达48.23 μmol/L和201.37 μmol/L左右。逆境恢复后,3% PEG处理的甜菜幼苗的相对含水量(96.94%)、丙二醛含量(17.22 μmol/L)以及植株形态基本恢复到了正常水平;而高浓度PEG胁迫复性后,9% PEG处理的植株的相对含水量虽然恢复了8.48%左右,但丙二醛含量仍旧相对含量高达36.46 μmol/L;而脯氨酸在各组处理中,一直维持在较高水平。qPCR分析表明,干旱胁迫诱导BvGS基因受到了不同程度的诱导表达,分别是处理前的3.85、4.45、5.81、8.20倍左右,即使恢复生长,植株中该基因的表达量虽然有所下降,但仍旧维持在较高水平。因此,可以推测,甜菜幼苗通过调整细胞水势、氧化还原水平、光合作用以及渗透代谢平衡来适应干旱胁迫所带来的失水和质膜过氧化等不良反应,并有可能通过谷胱甘肽的合成来解毒由干旱逆境所带来的氧化伤害。     

甜菜BvWRKY23基因的RNAi载体构建

WRKY转录因子家族成员在调控植物生长发育、应答生物与非生物胁迫等方面具有重要的生物学功能。以抗旱甜菜（Beta vulgaris L.）幼苗为材料,提取叶片总RNA并反转录为cDNA,通过RT-PCR方法扩增获得甜菜WRKY转录因子家族成员BvWRKY23基因的RNAi靶片段,以中间载体PBSK-RTM作为媒介,利用传统的“酶切-连接”法构建了含有CaMV 35S启动子、BvWRKY23基因片段反向重复序列的RNAi（RNA interference）植物表达载体pCambia2301ky-BvWRKY23-RNAi。     

甜菜磷脂酰肌醇转运蛋白基因SbSEC14的克隆及低温胁迫下的表达分析

磷脂酰肌醇转运蛋白(PITPs)广泛存在于真核生物细胞中,能够在体外膜脂质双层之间调控磷脂酰肌醇(PtdIns)或者磷脂酰胆碱(PtdCho)单体的独立转运。参与磷酸肌醇代谢、膜运输、极性生长、信号转导、逆境胁迫、胞浆运动和细胞周期调节等多种重要的生命过程,在植物的逆境响应以及发育调节中具有重要的作用。为了研究甜菜磷脂酰肌醇转运蛋白基因及其在低温胁迫下的表达情况。本研究以甜菜基因组数据库中一条预测的磷脂酰肌醇转运蛋白基因CRS1为模板,用基因克隆的方法得到一条全长765 bp,开放阅读框596 bp,编码198个氨基酸的甜菜SEC14基因,命名为SbSEC14。理化性质分析表明,该蛋白质为不稳定亲水蛋白;蛋白质二、三级结构分析表明,该蛋白质α-螺旋所占的比例最高,为47.47%,β-转角所占比例最低,为5.56%;蛋白质保守结构分析表明,该蛋白质有典型的SEC14结构域;蛋白质系统进化树分析表明,甜菜SbSEC14基因与菠菜、藜麦的磷脂酰肌醇运转蛋白基因亲缘关系最近;实时荧光定量结果表明,SbSEC14基因在甜菜中组成型表达,在甜菜叶中的表达量最高,在甜菜根中的表达量最低,在叶中表达量约为根中的2.5倍。甜菜幼苗4℃处理0、2、6、12、24 h,该基因在植株处理0~2 h时表达量呈上升趋势,在植株处理2~6 h时表达量呈下降趋势,在植株处理6~24 h时表达量趋于平稳状态。因此,预测该基因与甜菜抗低温胁迫相关。     

不同浓度钾素对甜菜幼苗生理生化指标的影响

试验采用1/2Hoagland营养液水培,研究不同浓度K⁺对甜菜幼苗生长和生理生化指标的影响。结果表明,甜菜幼苗叶片、叶柄、根系和整株的干物质量均随钾素浓度提高而增加,在K⁺浓度为3.00 mmol/L时最高;随K⁺浓度提高,甜菜幼苗根系、叶柄、叶片钾含量,幼苗全氮、磷、钾积累量,叶片、叶柄含水量,叶片相对含水量以及叶片面积随之逐步升高,3.00与6.00 mmol/L K⁺处理无明显差异;叶片叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b含量,SOD、GPX活性,根系、叶柄和叶片全N含量随之逐步下降,3.00与6.00 mmol/L K⁺处理无明显差异;叶片CAT活性,根系、叶柄和叶片P含量保持不变或变化无规律。在本研究条件下,3.00 mmol/L K⁺是甜菜幼苗生长最佳营养浓度。     

甜菜BvGSTU9基因的生物信息学及在镉胁迫下的表达分析

为了进一步研究甜菜谷胱甘肽转移酶BvGSTU9 (LOC104894060)在重金属胁迫过程中的功能。本研究以‘780016B/12优’为实验材料,对该基因序列特征、结构、功能进行预测分析,并利用qPCR检测该基因在不同浓度镉胁迫下的表达量变化。结果显示甜菜BvGSTU9基因全长925 bp,开放阅读框675 bp,编码了由224个氨基酸组成的不稳定膜外蛋白。BvGSTU9与菠菜、藜麦的氨基酸序列相似性较高,与系统发育进化树分析结果基本相符。二级和三级结构预测表明该基因主要由α-螺旋、β-折叠、延伸链及无规则卷曲组成。qPCR显示BvGSTU9基因在不同浓度的镉胁迫下均受到不同程度的诱导,因此可以推断甜菜BvGSTU9基因无论从结构还是功能上,与镉逆境胁迫存在着一定的应答关系。研究结果也为甜菜耐重金属镉机制研究提供参考依据。     

甘蓝型油菜响应低氮胁迫的表达谱分析

随着人们对作物产量的需求不断提高,氮肥被过量施用,而作物的氮素利用率(NUE)却在不断降低。本研究从低氮胁迫下油菜的生理变化入手,结合高通量的数字基因表达谱测序技术,分析了油菜在低氮0、3、72h下的转录组差异响应,鉴定了氮的吸收﹑转运﹑分配和转录因子等方面的差异表达基因。结果表明,甘蓝型油菜在低氮处理后,氮优先分配到地上部,硝酸还原酶(NR)活性显著降低,而谷氨酞胺合成酶(GS)活性升高,油菜植株总氮浓度降低, NUE升高。基因基因本位论(GO)功能与京都基因和基因组百科全书(KEGG)代谢通路分析表明,地上部差异表达基因主要是参与代谢过程、蛋白结合、离子结合、阴离子结合等,根中差异表达基因主要是参与分子功能、初级代谢过程、离子结合、阴离子结合等。基因表达谱分析表明,低氮胁迫72 h后,根中BnaGLNs家族基因表达大部分升高;根中BnaWRKY33s和BnaWRKY70s的基因表达量降低;BnaMYB4s、BnaMYB44s和BnaMYB51s亚家族中的大部分基因的表达量降低;BnaNIAs家族中的大部分基因表达上调;在BnaNRT2.1s和BnaNRT3.1s亚家族中,根中BnaA6NRT2.1 (BnaA06g04560D)、BnaA6NRT2.1 (BnaA06g04570D)、BnaA2NRT3.1 (BnaA02g11760D)、BnaC2NRT3.1(BnaC02g16150D)的表达上调。同时,地上部和根发生外显子跳跃(SE),外显子选择性跳跃(MXE)类型的可变剪接积极加强对低氮的适应。总而言之,在低氮处理下,甘蓝型油菜可以通过调控BnaNRTs、BnaGLNs、BnaNIAs家族基因提高NUE,以及调控BnaMYBs、BnaWRKYs家族和可变剪接积极适应低氮胁迫。     

甜菜TIFY基因家族的全基因组鉴定与生物信息学分析

TIFY转录因子对植物体生长发育和胁迫响应有重要调控作用,本研究目的在于鉴定分析甜菜(Beta vulgaris L.)中的TIFY转录因子。试验以甜菜基因组数据为基础,利用生物信息学技术在全基因组水平鉴定并分析甜菜TIFY家族成员。结果表明：甜菜中共有21条TIFY基因,基因间序列相似性较低;共线性分析发现只有BvTIFY15与BvTIFY18之间存在基因复制事件;BvTIFY转录因子家族包括2个TIFY蛋白、8个JAZ蛋白、6个ZML蛋白、5个PPD蛋白;蛋白互作预测发现,JAZ家族成员对JA信号有重要的调控作用。本研究对BvTIFY基因的结构与功能进行分析,发掘出甜菜根中应答盐胁迫基因BvTIFY13与BvTIFY15,为后续BvTIFY基因的功能研究提供一定理论基础。     

不同氮素水平对甜菜氮代谢酶和可溶性蛋白含量的影响

为了筛选合适的氮素施用量,研究氮素营养和氮素同化关键酶的关系,以尿素为氮源,采用HI003为试材,研究了不同的施氮水平对甜菜叶片、块根中可溶性蛋白含量、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的影响。结果表明：叶片中,硝酸还原酶的活性随着施氮水平的提高而增加,但是超过 200 kg/hm²酶活性下降;块根中硝酸还原酶活性在0~120 kg/hm²随着施氮量增加而上升,超过 160 kg/hm²酶活力下降。叶片、块根中,整个生育期施氮肥处理增加了谷氨酰胺合成酶活性。试验中发现施氮量和生育期早期的叶片中硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性呈显著正相关。施氮量和甜菜叶片可溶性蛋白含量在7月15日和9月15日呈显著正相关;在生育期内,氮素水平和块根中的可溶性蛋白含量呈极显著正相关。     

甜菜M14品系BvM14-RIN4基因的克隆及应答盐胁迫分析

为了研究甜菜单体附加系M14品系RIN4基因耐盐功能,本研究以甜菜M14品系为实验材料,通过PCR技术获得BvM14-RIN4基因cDNA全长序列,对BvM14-RIN4基因进行了生物信息学分析、组织特异性和应答盐胁迫分析。BvM14-RIN4基因ORF长度为264 bp,编码87个氨基酸,蛋白分子量为 9.67 kDa,理论等电点为9.64,初步鉴定该蛋白为亲水性蛋白;BvM14-RIN4蛋白质二级结构主要由延伸链和无规卷曲组成;BvM14-RIN4蛋白质三级结构预测出该蛋白的保守结构域和疏水区;系统进化树分析结果表明BvM14-RIN4蛋白与菠菜SoRIN4和藜麦CqRIN4蛋白亲缘关系最近;荧光定量PCR结果显示,BvM14 -RIN4基因在根中表达量是叶的2.26倍,说明其具有组织特异性;该基因在200 mmol/L NaCl处理后的根中上调表达,说明它参与甜菜M14品系应答盐胁迫过程。本研究在挖掘甜菜M14品系优质基因和开展甜菜遗传改良工作等方面具有重要意义,为后续该基因的功能研究提供了重要参考。     

甜菜对低氮胁迫的形态学响应机制

为了分析甜菜对低氮胁迫在形态学上的应答机制,本研究以甜菜种质资源‘780016B/12优’为研究对象,对缺氮(N 0 mmol/L)和低氮(N 1.5 mmol/L)条件下甜菜植株的形态和根系构型变化进行了深入分析。结果表明,甜菜遭受氮胁迫时,地上部生物量积累减少,地下部生物量积累增加,根冠比增加,叶面积减少,甜菜生长发育受到抑制。低氮胁迫7~14天后的根系面积、体积和根系分叉数增加量均大于对照(N 10 mmol/L)。氮胁迫下,甜菜的根系构型呈二分体状,且随着胁迫时间和缺氮程度的增加,地下生物量越大,这种状况表现的越为明显。因此可以推断,甜菜植株根系生物量的高低与根系构型有着密切的联系,甜菜通过改变根系比例和根系构型来获得氮素平衡。     

水涝胁迫对不同土壤盐碱度下甜菜幼苗生长及光合特性的影响

为探究水涝胁迫对不同土壤盐碱度下甜菜幼苗生长的影响,验证甜菜在水涝逆境中的生长规律,评估水涝胁迫对盐碱地甜菜种植的影响,以甜菜‘SV1433’为供试品种,以微酸性黑土为基础利用NaCl、Na₂SO₄、Na₂CO₃、NaOH调节土壤盐碱度,采用室内土培法,设置微酸土、盐渍土、盐碱土3个土壤盐碱梯度下对照及水涝胁迫共6组处理。结果发现,播种9天后出苗结束,微酸土中甜菜出苗较快,优于盐渍土及盐碱土;播种26天后收苗,在微酸土、盐渍土、盐碱土3种土壤盐碱度下,水涝胁迫比对照植株鲜重分别降低40.7%、26.9%、25.2%,干重分别降低41.1%、29.9%、24.8%,株高分别下降20.4%、19.1%、16.3%,表明随土壤盐碱度升高水涝胁迫对甜菜幼苗鲜重、干重、株高影响逐渐降低;水涝胁迫下幼苗根面积及叶面积显著降低,植株叶长显著下降,叶片净光合速率、蒸腾速率、叶片气孔导度显著降低,表现出水涝胁迫下盐碱土中甜菜幼苗生长较好,优于盐渍土及微酸土。     

内生真菌对甜菜主要农艺性状及氮糖代谢关键酶活性的影响

采用内生真菌F11液浸种、喷叶及灌根处理方法,调查其对甜菜栽培品种KWS2409的主要农艺性状及对甜菜氮、糖代谢关键酶即硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、蔗糖合酶(SS)和蔗糖磷酸合酶(SPS)活性的影响。结果表明,内生真菌F11菌株对甜菜的含糖量有明显的提高作用,其中以灌根处理效果最好,其叶鲜重、叶绿素含量、单根重、含糖率和产糖量的平均值分别提高了66.67%、47.42%、6.96%、17.46%和25.63%。在整个生育期,内生真菌F11显著提高了氮糖代谢酶活性,其中NR和GS活力分别呈“M”型双峰曲线和抛物线型变化,而SS和GS活力呈单峰曲线变化,后期根部SS合成活力明显高于分解方向活力,生育前期SPS活力高于后期。叶丛形成期达到最高峰,说明NR、GS、SS和SPS活性的增强是甜菜含糖量升高的主要生理原因。     

肾形肾形虫干预下甜菜幼苗的光合响应

为了探讨原生动物新物种肾形肾形虫(Colpoda reniformis)对甜菜幼苗的光合特征的干预情况以及对甜菜幼苗生长情况的影响。采取液体培养方法，选用中国农业科学院甜菜研究所育种品系701为试材，设置接种与未接种肾形肾形虫两个处理，通过生理指标分析和相关性分析来评价肾形肾形虫干预下甜菜幼苗基础表型特征以及光合特性。与未接种肾形肾形虫的处理相比，接种肾形肾形虫后，甜菜幼苗的表型特征及生物量的积累均有显著促进作用，植株的总株高、叶面积、根长、地上部和地下部干质量分别增加了14.14%、15.49%、20.09%、10.0%和33.3%。另外，接种肾形肾形虫后甜菜叶片的Pn、Gs、叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量显著高于对照，分别增加了43.91%、40.56%、31.58%、31.82%、31.72%。谷氨酰胺合成酶(GS)活性显著增加23.52%。氮素干物质生产效率和氮素积累量的地上和地下分别增加6.3%、8.8%和5.3%、19.7%。相关性分析表明光合特性的指标、氮效率以及植株的叶面积在甜菜生长过程中发挥重要作用。因此，肾形肾形虫可以干预甜菜幼苗的生长发育，通过增加叶面积、叶绿素含量来提高光合作用进而提高氮效率，最终促进甜菜幼苗的生长及生物量的积累。