鸡Ii基因的克隆、鉴定及其原核表达

从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中提取总RNA,用自行设计的一对引物通过RT—PCR方法扩增出鸡恒定链(invariant chain,Ii)基因片段。经酶切鉴定后,再将该片段克隆到pcDNA3载体中,测定其DNA序列,结果表明该片段长度为669bp,其DNA序列与GenBank登录的基本一致。再将该片段插入原核表达载体PGEX-4T-1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS—PAGE,获得分子量约为50kD的特定蛋白条带,表明所克隆的鸡Ii基因在原核细胞中得到表达。     

抗菌肽Fa-AMP基因的克隆及其原核表达载体的构建

为研究抗菌肽Fa-AMP的高效制备方法.采用大肠杆菌偏嗜性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列,通过重叠区扩增基因拼接法合成目的基因,并将其连接到表达载体pET-47b上,转化获得其BL21(DE3)pLysS工程菌,经PCR和测序鉴定,表明重组表达载体构建成功,这为体外生物活性检测与开发提供了参考.     

抗菌肽Fa-AMP基因的克隆及其原核表达载体的构建

为研究抗菌肽Fa-AMP的高效制备方法。采用大肠杆菌偏嗜性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸序列,通过重叠区扩增基因拼接法合成目的基因,并将其连接到表达载体pET-47b上,转化获得其BL21(DE3)pLysS工程菌,经PCR和测序鉴定,表明重组表达载体构建成功,这为体外生物活性检测与开发提供了参考。     

苹果AFL1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

AFL1基因是苹果控制花发育的关键基因之一。在已得到AFL1 cDNA基因的基础上,将AFL1克隆到原核表达载体pET28b中,获得了重组表达质粒pET-AFL1,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21中,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳分析,结果显示,AFL1基因在大肠杆菌中成功表达,表达的AFL1融合蛋白分子量大约为53 kD。     

脑膜炎奈瑟氏菌NspA基因重组乳酸菌表达载体的构建及原核表达

用Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切克隆质粒pMD-18T-NspA及可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的载体质粒pW425et,将NspA基因与pW425et表达载体用T4DNA连接酶相连,构建出重组质粒pW425et-NspA,将其转入至E.coli DH5α感受态细胞中,筛选阳性重组子进行SDS-PAGE和Wester...     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

MCL-1原核表达载体构建及重组蛋白表达

[目的]构建日本蟾蜍(Bufo japonicus formosus)髓细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1,mcl-1)的原核表达载体并诱导其重组蛋白表达。[方法]通过PCR方法扩增日本蟾蜍皮肤mcl-1开放阅读框,将其插入到原核表达载体pET-28b中。经菌落PCR、DNA限制性内切酶消化筛选阳性克隆,并通过DNA测序确定原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功。将pET-28b-mcl-1转入大肠杆菌(E.coli)感受态细胞BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE对重组蛋白的表达进行检测。[结果]原核表达载体pET-28b-mcl-1构建成功;重组蛋白在大肠杆菌中成功表达。[结论]原核表达载体的构建及重组蛋白的表达,为后续MCL-1的纯化、抗血清的制备及生理功能检测奠定了基础。     

禽流感病毒PA基因的原核表达载体的构建及鉴定

以重组质粒pcDNA-PA为模板扩增PA全基因,并构建原核表达载体pGEX-6p-1-PA。根据GenBank公开发表的禽流感病毒PA基因的序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pcDNA-PA中扩增禽流感病毒的PA基因,将该基因定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1中,然后将连接产物转化宿主菌DH5α,挑取阳性克隆进行PCR和BamHⅠ、NotⅠ双酶切鉴定并测序。测序结果表明,禽流感病毒PA基因全长2151 bp,编码717个氨基酸,原核表达载体pGEX-6p-1-PA已构建成功。从而为禽流感蛋白PA的表达及其多克隆抗体的制备奠定了基础。     

人肥胖基因大肠杆菌表达载体的构建及其诱导表达

通过设计1对PCR引物（上游引物,5-′GCCATATGGTGCCGATCCAAAAAG-3′,下游引物,5-′GAGAATTCCCTTCAAGGCCTCAG-3′）,采用PCR方法扩增出人肥胖基因编码成熟肽的核苷酸序列,将扩增产物从琼脂糖凝胶上回收后插入测序载体pMD-18-T后进行了核苷酸序列测定。将经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的扩增产物插入经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的大肠杆菌表达载体pET-28a（＋）,构建了可在大肠杆菌中高效表达人瘦蛋白的表达载体。将表达载体转化入大肠杆菌菌株BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测,结果表明构建的人肥胖基因表达载体得到高效表达,重组蛋白占到菌体总蛋白的31.2%。     

水疱性口炎病毒N基因原核表达载体的构建及表达

针对水疱性口炎病毒(VSV)N基因设计特异性引物,在引物中分别加入EcoR 和Xho 酶切位点。RT-PCR扩增后得到目的基因,将其克隆到表达载体pET30c,连接产物转化于DH5α菌株,在含Kan+的平板上37℃培养24h,然后挑取白色菌落,鉴定为阳性者,转化于BL21菌株,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导获得高效表达。表达融合蛋白分子质量为53ku(目的蛋白大约47ku),同预期蛋白大小相近。Westernblot检测表明,其能与本病毒阳性血清发生特异性反应,表达蛋白有望成为有价值的VSV诊断抗原。     

犬细小病毒VP_2基因原核表达载体的构建与分析

从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamH I和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.     

重组hIL-24原核表达载体的构建及表达

采用基因克隆的方法构建人白细胞介素(hIL-24)基因的原核表达载体pET-28a(+)-hIL24,在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白rhIL-24,SDS-PAGE和Western blotting分析蛋白表达,探讨其最佳诱导表达条件.结果表明:hIL-24基因的表达产物分子质量约25 ku,且以包涵体的形式存在于超声裂解后的沉淀中,重组蛋白rhIL-24可特异性被鼠抗人IL-24单克隆抗体识别.当IPTG终浓度为0.5 mmol·L~(-1)、37℃诱导8 h时,其表达量最高.hIL-24基因在该原核表达系统中的成功表达,为其生物学功能的研究奠定了基础.     

小麦甲基结合蛋白基因MBD3重组表达载体的构建和原核表达

DNA甲基化在基因表达调控过程中发挥重要作用,甲基结合蛋白(Methy1-Binding Domain Protein, MBD)是能特异识别甲基化位点的反式作用因子.开展植物MBD基因的功能研究对于探讨植物生长发育的表观遗传学调控机制具有重要意义.该研究构建了小麦甲基结合蛋白基因MBD3的原核表达载体pGEX-4T-MBD3,转化大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株,在37℃,lmMIPTG浓度条件下,成功诱导表达了的GST-MBD3融合蛋白,大小为49.6kDa,这为进一步开展MBD3的蛋白纯化和功能分析奠定了基础.     

牛疱疹病毒I型gB基因原核表达载体的构建和高效表达

用PCR法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型B artha N u/67株gB基因,将其插入原核表达载体pBAD/TOPO中构建重组质粒pBAD-gB。将pBAD-gB质粒转化大肠杆菌TOP 10后进行了诱导表达,对表达产物进行了纯化和抗原性检测,并通过改变诱导剂L-A rab inose的浓度和诱导时间对诱导表达条件进行了优化。结果表明,重组质粒pBAD-gB构建成功,gB蛋白获得了高效表达,并以包涵体形式存在,纯化后gB蛋白的纯度达90%以上,gB蛋白抗原性良好,最佳诱导表达条件:L-A rab inose终浓度为0.2 g/L,诱导时间为5 h。     

三黄鸡STING胞外区基因克隆及原核表达

[目的]克隆鸡干扰素基因刺激蛋白(STING)胞外区基因并进行原核表达,为了解STING蛋白的生物学功能及探讨禽类的固有免疫机制打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增鸡STING胞外区基因,与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组表达质粒,再转化BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行12% SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析.[结果]三黄鸡STING胞外区基因全长951 bp,与原核表达载体pGEX-4T-1可成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-STING,转化BL21 (DE3)感受态细胞后经1.0 mmol/L IPTG诱导表达4h,12% SDS-PAGE电泳检测得到一个带GST标签约62 ku的融合蛋白,采用抗GST多克隆抗体进行Western blotting鉴定,约在62 ku处可见一条明显的蛋白印迹条带,表明目的蛋白原核表达正确,且特异性较高.[结论]从三黄鸡外周血淋巴细胞中克隆获得的STING胞外区基因片段可在原核细胞中高效表达,且纯化后的融合蛋白可用于制备鸡STING多克隆抗体.     

大麦黄矮病毒GPV株系运动蛋白基因原核表达载体的构建

大麦黄矮病毒GPV株系ORF4基因编码一种17 kDa的蛋白,利用一对特异性引物,通过RT-PCR对ORF4基因进行了扩增,序列测定表明其长度为456 bp,与已报道的序列一致,并构建了原核表达载体。     

油菜乙酰羟基酸合酶基因BnAHAS1的克隆及其重组蛋白质的原核表达

利用RT-PCR技术从甘蓝型油菜宁油16号(Brassica napus L.)中克隆到乙酰羟基酸合酶基因BnAHAS1的cDNA序列,该序列含有1个1 968 bp的开放阅读框,编码蛋白质655个氨基酸,分子量约为7.1×104,预测等电点为6.16。将该基因克隆到原核表达载体pCold II中,经酶切和测序鉴定后,将正确的重组质粒pCold IIBnAHAS1导入大肠杆菌BL21(DE3)。在15℃下以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导12 h后,获得预期大小的重组蛋白质His-BnAHAS1,并用Western blot确定此重组蛋白质为目的蛋白质。     

HSV_1-TK基因原核表达载体的构建及表达检测

探讨自杀基因HSV1-TK原核表达情况,为进一步将细菌载体应用于肿瘤基因治疗奠定基础。首先以质粒pHSV-106为模板,通过PCR获得HSV1-TK基因克隆并将其与原核表达载体pGEX-6P-1连接,重组质粒经鉴定后将其转化到E.coli BL21,观察其蛋白表达情况。结果表明,TK基因全长1 128 bp,与理论值相符。经测序发现插入到载体pGEX-6P-1上的DNA片段与TK基因的同源性为100%;SDS-PAGE可明显看出大小为41 ku的TK酶表达,并随时间的延长表达量不断增加。试验证明来源于单纯疱疹病毒的胸苷激酶能够实现原核表达,这一结果是应用细菌载体携带自杀基因TK治疗肿瘤的前提。