白粉菌侵染Pm21近等基因系的早期蛋白组差异研究

分析接种小麦白粉菌E09后Pm21近等基因系及其亲本叶片的总蛋白质差异,从蛋白质组调控角度揭示Pm21基因抗白粉病的抗病机理。以Pm21近等基因系及其亲本百农3217为试材,显微观察接种后5 d内的叶片表面细胞与白粉菌孢子表型差异;采用非离子去污剂提取总蛋白质,运用双向电泳、质谱分析与数据库检索技术,比较Pm21近等基因系及其亲本接菌第4天后的叶片总蛋白质差异。超显微和显微观察结果表明,12 h后百农3217叶细胞表面与Pm21近等基因系相比褶皱明显;在接菌第2天后,在Pm21近等基因系白粉菌孢子生长明显慢于其亲本表面孢子,且孢子侵入个数较少,不萌发现象较多;在第4天后Pm21近等基因系被侵染叶片细胞出现过敏性反应;通过MALDI-TOF-MS/MS质谱测序和MASCOT软件序列分析,注释了15个表达上调蛋白点;功能分类表明,差异蛋白质分别参与叶绿体光合呼吸作用(40%)、放氧作用(13%)、代谢物合成(20%)、抗病、动力蛋白、运输等生理功能。蛋白质组水平发现,光合呼吸蛋白和叶谷氨酰胺合成酶在Pm21近等基因系感病3～4 h后就大量表达,可能是导致叶片明显变绿原因;叶谷氨酰胺合成酶的增加与光合呼吸蛋白的增加密不可分;光合呼吸蛋白和抗坏血酸过氧化物酶的上调表达为植物体在高H2O2浓度下正常生长提供了保障。另外,β-1,3-葡聚糖苷酶的过量表达也是Pm21基因前期抵御白粉菌侵染有效物质。钾离子通道蛋白可能在抗病防御过程中起到了信号转导的作用。     

大豆叶片响应CO2浓度升高、干旱及其交互作用的转录组分析

气候变暖及大气CO₂浓度升高成为全球共识,由此增加极端天气气候事件(干旱)发生的频率和强度并对大豆生产带来不确定性。本研究通过大豆表型和叶片转录组测序(RNA-seq)分析,阐释CO₂浓度升高、干旱及其交互条件对大豆基因表达影响,明确CO₂浓度升高影响大豆耐旱性的调控途径,并在两个不同遗传背景品种中验证,从分子水平为未来气候变化背景下大豆抗旱育种提供理论参考。表型结果表明, CO₂浓度升高促进了大豆的生长并缓解干旱胁迫的负面效应。叶片转录组测序分析共筛选到89个CO₂响应基因, KEGG分类显示这些基因主要参与抗氧化物质(萜类、黄酮类等)代谢,同时特异性差异表达基因功能主要集中在细胞组分和生长发育方面。干旱条件下筛选的1006个差异表达(16倍)基因主要参与各类氨基酸(脯氨酸、色氨酸等)代谢途径,绝大多数蛋白质合成与转运相关基因上调,表明干旱胁迫下大豆叶片内物质合成交换过程加强。交互条件下筛选出的8566个差异表达基因主要参与碳水化合物代谢,光合作用-天线蛋白途径的相关基因几乎...     

大豆品种成熟期基因型推测的研究

选择不同来源中国大豆品种23份和国外引进的成熟期近等基因系35份进行SSR分析,目的是鉴定与成熟期基因型紧密连锁的标记,进而推测中国大豆品种的成熟期基因型。结果表明,（1）210对SSR标记中125对在成熟期近等基因型中具有多态性,推测与成熟期有关的标记有8个;（2）在Clark近等基因系中,筛选出成熟期基因E3/e3特异性标记Satt229,E4/e4的特异SSR标记Sct_010、Satt294、Satt247、Satt452和Satt156;在Clark和Harosoy近等基因系中,筛选出E7/e7的特异性SSR标记为Satt071、Satt178;（3）根据8个与成熟期相关的标记的分子数据,构建了国外大豆近等基因系的UPGMA聚类图,共聚为4类,背景来源相同或相似的材料被聚为一类,明显分为Clark近等基因系和Harosoy近等基因系。（4）与近等基因系成熟期基因(E7)分子标记比对,推测出25份中国大豆品种的成熟期基因。     

120份大豆种质资源遗传多样性和亲缘关系分析

采用覆盖20条染色体的68对多态性引物在120个大豆品种（系）[包括67个中国大豆品种（系）和53个引自美国的品种（系）]进行遗传多样性及亲缘关系分析。结果表明,120份大豆材料具有丰富的遗传多样性（N_a=1.9852,N_e=1.4343,H=0.2776,I=0.4361）;中国大豆比美国引进大豆遗传多样性水平高;7个群体遗传多样性由高到低为,黄淮海地区组>引种资源组>热带亚热带地区组>长江流域地区组>北方春大豆组>西南山区组>鲜食大豆组;7个群体间总遗传多样度（H_t）为0.2807,群体内遗传多样度（H_s）为0.2361,群体间遗传分化系数（G_st）为0.1589,基因流（N_m）为2.6468,群体间存在中低度遗传分化,遗传变异主要存在于群体内部,群体间N_m较丰富;以群体和单个品种（系）为单位进行UPGMA聚类的结果基本一致,部分材料相互交错。大豆种质遗传多样性与地理来源具有一定相关性的同时,不同地区间存在丰富的基因交流;黄淮海地区、西南山区、热带亚热带地区和长江流域地区的大豆材料遗传距离较近;引进大豆、北方春大豆和鲜食大豆与其他群体遗传距离较远,可作为拓宽中国栽培大豆遗传背景的物质遗传基础。     

大豆BIEX群体维生素E含量的遗传分析

大豆高维生素E含量专用品种的选育是现代大豆品质育种的重要方向,为给大豆高维生素E含量专用品种选育提供遗传学依据,通过对大豆重组自交系群体2008-2009年的维生素E含量进行相关的遗传分析,以Essex×ZDD2315衍生的208个重组自交家系群体BIEX为材料,用主基因+多基因混合遗传模型,分析大豆α-、γ-、δ-生育酚含量以及VE总含量的遗传机制。结果表明,α-生育酚含量、γ-生育酚含量以及VE总含量均属于2对主基因+多基因遗传模型,主基因遗传率分别为59.62%,75.99%,77.05%,多基因遗传率分别为35.90%,13.96%,15.05%;δ-生育酚含量属于1对主基因+多基因遗传模型,主基因遗传率为50.39%,多基因遗传率为38.11%。维生素E及其组分含量遗传涉及主基因和多基因,主基因遗传率在50%以上,多基因遗传率在10%以上,建议育种中要兼顾主基因和微效多基因的利用。     

油菜MICMS恢复基因近等基因系的构建与近等性分析

以宁R7为恢复基因源,利用连续回交法构建以T78、T84和ZS9三个优异种质为遗传背景供体的近等基因系候选株系。于成熟期考察并比较候选株系农艺性状,同时采用SSR标记对候选株系进行PCR扩增估算遗传相似系数并进行聚类分析。农艺性状分析(t测验)表明,不同候选株系与其供体的农艺性状具有不同程度的相似性,株高和分支点高度的差异程度较其他性状高。采用75对SSR引物对21个候选株系PCR扩增共得到157个目的片段,发现三个遗传背景候选株系的平均遗传相似系数分别为0.86、0.92和0.98。农艺性状与SSR标记综合分析后,认为wh13、wh59和wh118分别为三个种质的最优近等基因系。综上表明,采用农艺性状比较与分子标记相结合分析近等性是一种有效的近等基因系的检测方法。中选近等基因系可用于恢复基因的定位及克隆。     

大豆GmTINY1基因的克隆与表达分析

采用基因芯片技术,从大豆中鉴定了一个荚优势表达基因。利用生物信息学的方法,拼接了该基因的全长序列,并通过RT-PCR克隆了该基因。Blast检索分析表明,该基因编码一个具有AP2结构域的转录因子,且与拟南芥DREB类蛋白TINY的氨基酸相似度最高,将该基因命名为GmTINY1。GmTINY1包含一个735 bp的开放阅读框,编码244个氨基酸残基。GmTINY1与拟南芥TINY和TINY2蛋白的相似度分别为59%与62%。系统发生分析表明,GmTINY1、TINY和TINY2位于一个分支,且同属于DREB亚家族。实时定量RT-PCR检测表明,GmTINY1基因在荚中高丰度表达,在花中的表达量也较高,在根中的表达量较低,而在叶片中未检测到表达。基因芯片信息分析结果表明,GmTINY1在种子发育的子叶期的种脐部分高丰度表达。由此推论,GmTINY1基因在大豆生殖器官发育中可能发挥调控作用,可能与种子发育过程中种脐的形成有关。     

大豆KCS基因的克隆及结构预测

以大豆叶片总RNA为模板,利用RT-PCR方法,克隆获得大豆KCS基因序列。采用生物信息学方法对其进行预测分析,结果表明:大豆KCS基因的CDS序列长度为1533bp,编码510个氨基酸;大豆KCS基因编码的蛋白质理论分子量为57.1kD,等电点为9.03;该基因编码的蛋白具有两个完全跨膜结构;没有信号肽;其蛋白质二级结构中α螺旋占47.65%,无规则卷曲占35.88%,β折叠占16.47%;在进化关系上,与油茶、菟葵、苜蓿的亲缘关系相对较近,该研究结果可为大豆KCS基因结构和功能的进一步研究提供理论参考。     

利用分子标记辅助选择优质蛋白玉米近等基因系

为了扩增优质蛋白玉米育种新种质,用普通玉米种质转育创制优质蛋白玉米(QPM)近等基因系;利用SSR标记phi057进行辅助选择,以优质蛋白玉米种质为o2基因供体,转导、构建来自不同遗传背景普通玉米种质为受体的QPM近等基因系。结果表明：利用共显性SSR标记引物phi057在o2基因供体自交系与普通玉米受体自交系间表现多态性,能区分O2O2、O2o2和o2o2等3种基因型,来自不同遗传背景种质所构建获得的QPM近等基因系赖氨酸含量有不同程度提高,赖氨酸含量达到0.36%~0.42%,不同遗传背景受体自交系赖氨酸增加幅度9.1%~64.0%。普通玉米种质导入供体o2基因后能够提高种质赖氨酸含量。     

大豆基因组和转录组的核基因密码子使用偏好性分析

研究大豆核基因密码子的使用模式,探讨影响其密码子组成和编码特点的因素,为运用基因工程技术提高改良大豆提供理论依据。以大豆基因组的46 430个高置信编码基因和2 071条大豆全长转录本序列为数据来源,应用CodonW软件对大豆全基因组密码子组成、同义密码子使用频率和全长转录组编码区密码子使用各项参数的计算和统计分析发现,基因的表达水平与编码区G+C和GC3s含量均呈极显著正相关,且G+C和GC3s含量越高的基因密码子使用偏好性越高,并确定了UCC和GCC为大豆最优密码子。编码区长度分组分析表明,密码子使用偏好性随编码区长度的增加而降低,编码区较长的基因则趋向于随机使用密码子,且在转录组数据范围内,编码区长度介于400~600 bp的基因表达水平最高。大豆叶片和种子中特异表达基因的密码子使用偏好性和基因表达水平较为接近,但种子特异表达基因的G+C和GC3s含量均显著高于叶片特异表达基因,而其芳香族氨基酸含量则极显著低于叶片特异表达基因。     

作物叶片蛋白质组提取与酶切方法比较研究

蛋白质组样品制备主要涉及蛋白质的提取和酶切处理,是蛋白质组学分析的限制环节之一。为了提高作物叶片蛋白质组样品制备的效率和重复性,系统比较了6种缓冲液（pH8.5 Tris-HCl酚、pH7.0磷酸盐、pH9.0碳酸盐、尿素/硫脲、pH8.0 Tris-HCl、pH4.5醋酸盐）和TCA-丙酮处理对水稻、小麦、大豆和玉米叶片蛋白质提取的影响,同时以小麦叶片总蛋白和牛血清白蛋白为样本,比较了传统方法和微波辅助方法的酶切效率。结果表明,TCA-丙酮处理的小麦和水稻样品采用尿素/硫脲方法能获得较高的蛋白得率,而玉米和大豆样品采用尿素/硫脲直接提取时蛋白质得率更高,同时,微波辅助酶切值得用于蛋白质组样品制备。本研究采用适当的蛋白质提取和酶切方法,有效提高了蛋白质的提取率和鉴定率,可为进一步深入开展作物叶片的蛋白质组学研究提供借鉴。     

Breeding and characterization of soybean Triple Null; a stack of recessive alleles of Kunitz Trypsin Inhibitor,Soybean Agglutinin,and P34 allergen nulls

Soybean (Glycine max) seeds contain bioactive proteins with antinutritional and immunological properties that affect metabolism and assimilation of nutrients. The presence of antinutritional proteins requires soybeans to be heat‐treated resulting in input energy costs. Nulls for bioactive seed proteins have been previously isolated from the USDA soybean collection, including Kunitz trypsin inhibitor (TI), soybean agglutinin (LE) and immunodominant soybean allergen P34 protein. Each of these nulls has the potential to partially address the concerns of soybean feed/food consumption. A stack of recessive nulls of TI, LE and P34 was created in a cv ‘Williams 82’ background termed ‘Triple Null’. Triple Null has a slight reduction of total protein compared with ‘Williams 82’ corresponding to aggregate contribution of TI, LE and P34 in the seed proteome. Triple Null's proteome analysis revealed P34 and TI nulls are frame‐shift mutants able to accumulate small amounts of authentic P34 and TI proteins. Triple Null has possible application as a conventional feed/food source and for immunotherapy to mitigate soybean allergenic response.     

SiASRs家族基因的鉴定及表达分析

ASR蛋白是植物特有的一类蛋白,是参与并提高植物抗旱性和耐盐性过程中非常重要的蛋白之一。利用生物信息学方法,对8个谷子SiASRs家族基因编码的蛋白进行理化性质的分析、启动子的分析和系统进化树构建等,并结合qRT-PCR进行10% PEG-6000和150mmol/L NaCl胁迫下的表达分析。结果表明,谷子SiASRs家族的8个基因编码的蛋白都包含典型的ABA/WDS结构,该基因家族编码的蛋白质都不具有信号肽。系统发育树分析结果表明,在遗传进化上谷子与柳枝稷亲缘关系较近,与双子叶的番茄和大豆ASR蛋白的亲缘关系较远。PEG胁迫下基因的表达分析显示,8个SiASRs基因在受到PEG胁迫诱导后在根、茎、叶中表达量差异显著。NaCl胁迫下基因的表达分析结果显示,8个ASR基因对NaCl胁迫的响应主要在叶中体现,整体呈上调表达趋势;8个ASR基因在茎中表达变化较为稳定;在根部主要由ASR1、ASR2、ASR4、ASR5、ASR6参与NaCl胁迫响应,均为上调表达。     

国外种质对中国大豆育成品种遗传贡献的分子证据

用SSR标记对32份中国大豆品种与40份国外引进大豆育成品种祖先亲本的遗传多样性进行分析,以明确引进国外大豆种质对中国大豆育种的遗传贡献。结果表明,在22个SSR位点共检测到170个等位变异,中国大豆和引进国外大豆平均等位变异数分别为6.0和6.9个,遗传多样性指数都为0.71,国外品种中检测到48个特有等位变异,而中国大豆中仅检测到22个,且共有等位变异在中外大豆中的分布频率差异较大。聚类分析也发现中国育成品种与国外引进大豆存在较大差异。遗传组成分析发现,Amsoy和十胜长叶2个国外种质的引入使5个中国大豆育成品种增加了23个国外种质特有等位变异;其在育成品种中的保留比例为29.13%,但不同遗传背景中保留的等位变异不同,说明国外种质在中国大豆育种中起着重要作用,而且仍有很多特有等位变异没有被利用,可以继续作为亲本在中国大豆改良中发挥作用。     

利用酵母双杂交系统筛选大豆结瘤因子受体NFR1α的互作蛋白

大豆是重要的植物蛋白作物和粮豆间作作物,挖掘大豆的生物固氮潜力,对推动生态农业的可持续发展具有深远意义。大豆结瘤因子受体蛋白GmNFR1?(Nod Factor Receptor)对结瘤至关重要,但其具体调控机制尚不明确。本研究以大豆mRNA为模板,利用RT-PCR方法扩增到GmNFR1α蛋白的激酶结构域(GmNFR1α-pk),构建了pGBKT7-GmNFR1α-pk诱饵表达载体,通过酵母双杂交技术,筛选大豆根瘤AD-cDNA文库,从文库中分离到与GmNFR1α-pk相互作用的71个阳性克隆,经测序和同源性分析筛选到12种与GmNFR1α-pk互作的蛋白,包括钙离子结合手性蛋白、豆血红蛋白、结瘤素Nod44等蛋白。以大豆豆血红蛋白GmLbc2为例,回转酵母以及烟草体内BiFC验证其与诱饵蛋白的相互作用,对其进行同源蛋白比对及系统进化树分析,并利用百脉根毛根转化技术鉴定GmLbc2在结瘤过程中的生物学功能。研究结果进一步补充和完善了GmNFR1α介导的结瘤信号传递途径,为大豆与根瘤菌共生互作机制提供了新的分子证据。     

小麦杂交F1和双亲幼苗动态蛋白质组分析

分别以2,3,5 d叶龄的栽培小麦京411、偏硬001和杂交F1幼苗为材料,利用动态蛋白质组技术,对F1及双亲的蛋白质变化做了比较分析,结果表明,在双亲及F1中蛋白质差异表达现象被观察到,其中在5 d的叶子中最为明显。如在发育2 d和3 d的F1叶子中,各有15个蛋白质斑点的含量产生变化,而在5 d叶龄的叶子中,这种有变化的蛋白质斑点达27个,在这些变化的蛋白质中,偏双亲和低于双亲的为多数,如5 d的叶子中分别占41%和44%,同时,在F1叶片中观察到有蛋白质消失和新的蛋白质诱导现象产生。这些结果表明,杂种中存在蛋白质的差异表达现象,展开这方面的研究有助于对杂种优势形成机理的理解。     

不同耐旱性青稞叶片差异蛋白分析

为从蛋白质水平揭示不同青稞品种响应干旱胁迫的差异,分析抗旱蛋白质分子机制,本研究以干旱胁迫不敏感的旱地紫青稞(HDZ)和干旱胁迫敏感的大麻青稞(DM)为研究材料,以盆栽限量供水种植方法,对干旱处理不同梯度的青稞叶片进行叶绿素、可溶性蛋白、丙二醛含量及相对电导率4项生理指标的测定,同时利用iTRAQ技术对深度干旱胁迫青稞叶片全蛋白组进行差异蛋白分析。结果表明:随着干旱处理时间的延长,两种青稞的叶绿素和可溶性蛋白含量逐渐下降,电导率及丙二醛的含量逐渐升高,在相同处理条件下,大麻青稞的叶绿素和可溶性蛋白含量降低幅度、电导率及丙二醛含量的增高幅度明显高于旱地紫青稞;对两个青稞品种的干旱胁迫和正常培养的比较组进行iTRAQ分析,共定量出4163个蛋白(多肽),其中旱地紫青稞比较组中对比正常培养,筛选到表达上调的蛋白68个,下调的蛋白63个,在大麻青稞的比较组中筛选出表达上调蛋白21个,下调蛋白32个。KEGG通路分析表明,富集程度位于前3位的通路是代谢、氨基酸的生物合成以及次级代谢产物的生物合成,主要涉及到柠檬酸循环、碳循环等代谢通路,丙氨酸、精氨酸等氨基酸的合成降解以及花生四烯酸、亚麻酸等次级...     

辣椒Arf GAP基因的克隆与表达分析

ADP核糖基化因子(Arf) GTP酶激活蛋白(GAPs)能够促使束缚于Arfs的GTP水解为GDP,通过转化具有活性的GTP束缚型为非活性的GDP束缚型从而达到调节Arfs的作用。本研究从辣椒幼苗叶片cDNA文库中筛选获得一个阳性克隆。核苷酸序列分析表明该基因编码一个含有408个氨基酸残基,分子量约为43.98 kD,含有一个保守的Arf GAP结构域,与葡萄、大豆中的AGD8-Like基因的同源性分别为73%和71%,与拟南芥AtAGD8同源性为65%,命名为CaAGD8。实时荧光定量PCR检测表明,与对照相比,CaAGD8基因的相对表达量在辣椒茎、叶、花及果实中表达量升高。     

低温胁迫下白菜型冬油菜差异蛋白质组学及光合特性分析

分离鉴定白菜型冬油菜低温差异表达蛋白质, 从蛋白质组角度揭示白菜型冬油菜抗寒机理奠定基础。以强抗寒白菜型冬油菜陇油7号为材料, 采用双向电泳和质谱分析技术, 比较低温(4°C、–4°C)和常温(25°C/20°C)下叶片蛋白质组差异;对差异蛋白进行KO和KEGG功能分析。结果表明,低温下陇油7号生长点下陷、植株匍匐, 气孔处于关闭或半关闭状态。2-DE和PDQuest8.0.1软件分析表明, 常温和4°C低温下叶片蛋白质斑点数分别726、738;相对于常温处理, 4°C低温下陇油7号叶片10个蛋白点特异表达、5个蛋白点未表达;MALDI-TOF-TOF MS质谱分析鉴定出11个蛋白质, 参与碳水化合物代谢、糖代谢、氨基酸代谢、有机酸代谢、核酸代谢、信号转导与细胞通讯等细胞过程。冰晶形态显微观察结果表明低温处理后陇油7号叶片蛋白质提取液中含有高活性抗冻蛋白(antifreeze proteins, AFPs)。鉴定的11个蛋白质中, 有5个蛋白质点与光合作用有关, 低温下陇油7号叶片1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBPCase)活性和净光合速率Pn下降。叶片Pn下降与RuBPCase表达抑制和活性降低有关, 非气孔限制是Pn下降的主要因素;高活性抗冻蛋白在白菜型冬油菜抗寒中发挥重要作用。