利用噬菌体随机十二肽库筛选生长抑素抗原模拟表位

用生长抑素(somatostatin,SS)疫苗“激生1号”免疫日本大耳兔得到抗血清,经饱和硫酸铵粗提IgG,再经DEAE-sephadex-A50低压层析系统纯化后,以此IgG作为筛选配基,对随机十二肽库进行4轮淘洗。随机挑取22个噬菌斑进行双夹心ELISA,结果有6个克隆与SS抗体有较强的特异性结合力,竞争抑制ELISA进一步证明6个克隆有较好的抑制作用。将6个阳性克隆提取ssDNA进行测序,测序结果中有5个克隆的外源肽序列完全一致,经与SS氨基酸序列比对,发现两者有共同序列FWK,说明5个克隆模拟了生长抑素的抗原表位。     

利用噬菌体随机肽库筛选抗原模拟表位的研究进展

噬菌体随机肽库技术是将编码外源多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白结构基因的表达而表达,被展示的外源多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性,是一种基因型与表达型的统一。近年来,噬菌体随机肽库技术被广泛应用于各种抗原的模拟表位筛选中,并取得了显著成果。综述了利用噬菌体随机肽库技术在抗原模拟表位筛选中的研究进展。     

应用噬菌体随机十二肽库筛选猪传染性胸膜肺炎菌体抗原模拟表位

利用猪传染性胸膜肺炎灭活菌苗免疫日本大耳兔得到猪传染性胸膜肺炎抗血清,将血清用饱和硫酸铵粗提IgG后,经DEAE-sephadex-A50低压层析系统纯化,以此得到IgG作为配基包被酶标板,对噬菌体随机十二肽库进行3轮不同条件的富集筛选,通过改变筛选条件,噬菌体的回收率从5.76×10-5增加到了1.69×10-2,P/N值逐步提高;随机挑取10个噬菌斑进行扩增,用ELISA检测其免疫活性,结果有6个阳性克隆与纯化的IgG有较强的特异性结合能力;对筛选到的6个阳性克隆提取ssDNA进行测序,并分析其氨基酸序列,其中5个克隆所递呈的序列一致,用Blastp软件进行分析,2种类型的氨基酸序列之间无同源性,且未发现同源性50%以上的序列,提示该短肽可能模拟了猪传染性胸膜肺炎菌体的特异的抗原表位。     

M13噬菌体肽库扩增及兔抗血清制备

为制备M13噬菌体多克隆抗体,将噬菌体十二肽原始文库进行大量扩增,作为免疫原制备兔抗M13的多克隆抗体血清并进行间接ELISA鉴定。结果表明,该多抗效价达1 1 048 576,说明此多抗可与扩增噬菌体文库发生很好的抗原抗体反应。将制备的噬菌体M13多克隆抗体与商业化M13抗体水平比较,制备多抗与商业化M13抗体效果相当。本研究成功制备兔抗M13噬菌体多克隆抗体,为深入研究噬菌体展示技术提供了材料。     

从噬菌体随机七肽库中筛选抗H3N2亚型犬流感病毒多肽的研究

【目的】以纯化的H3N2亚型犬流感病毒HA1蛋白为作用靶点,从噬菌体随机七肽库中筛选出具有抗流感病毒活性的亲和多肽.【方法】运用噬菌体展示技术,以纯化的H3N2亚型犬流感病毒HA1蛋白为作用靶点,从噬菌体随机七肽库中筛选HA1蛋白亲和多肽,并对获得的多肽进行鸡胚水平和细胞水平抗H3N2亚型流感病毒活性验证.【结果和结论】经过4轮体外亲和筛选获得了6条HA1蛋白亲和多肽,6条多肽对H3N2亚型流感病毒有不同程度的抗病毒活性,其中以HA-4的抗病毒活性最强.试验结果表明噬菌体随机肽库技术能够应用于抗病毒研究.     

胰腺癌人源噬菌体单链抗体库的构建及初步筛选

提取胰腺癌患者的外周淋巴细胞总RNA,以RT-PCR技术分别扩增出人源抗体H链和L链的可变区基因,采用SOE-PCR法将VH和VL片段随机拼接成scFv片段,然后将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,并电转化至感受态TG1菌,经辅助噬菌体M13K07拯救,获得胰腺癌人源噬菌体单链抗体库。结果表明,从外周血淋巴细胞中获取可变区基因,利用噬菌体抗体库技术制备人源抗胰腺癌单链抗体的策略是可行的。     

噬菌体抗体库的构建及抗猪脂肪细胞膜单抗的筛选

 用猪脂肪细胞以免疫删减法免疫小鼠，取其脾细胞，RT-PCR扩增抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆入噬菌粒表达载体pCANTAB5E中，构建单链抗体（ScFv）文库。用猪脂肪细胞，对其进行3轮吸附-洗脱-富集，筛选抗猪脂肪细胞膜单抗。经ELISA检测，51/96克隆具有与猪脂肪细胞结合活性，阳性率为53%，与猪肝细胞则成阴性反应，初步证明了单抗的特异性，为猪脂肪细胞膜单抗的制备提供了一种新的方法。     

天然鼠源噬菌体抗体库的构建及抗羊抑制素基因工程单抗的筛选

 【目的】构建单链抗体（ScFv）噬菌体表面展示文库,从中筛选抗羊抑制素单抗并进行表达,建立制备羊抑制素单抗的新方法。【方法】用未经免疫的多种小鼠脾细胞作为基因来源,采用噬菌体抗体库技术,构建天然噬菌体表面抗体文库。用羊抑制素对其进行3轮吸附-洗脱-富集,筛选抗羊抑制素单抗,用ELISA检测其抗原结合活性。【结果】构建了天然鼠源噬菌体抗体库,为筛选和制备各种单链抗体提供了一个平台。用羊抑制素对其进行筛选,制备抗羊抑制素单抗,经ELISA检测,55/96克隆具有与羊抑制素结合活性,阳性率为57%。【结论】制备的羊抑制素可溶性ScFv及其表面展示噬菌体抗体有很好的抗原结合活性,为羊抑制素单抗的制备提供了一种新的方法。     

噬菌体抗体库技术在水产养殖中的研究进展

噬菌体抗体库技术是将目的基因克隆到噬菌体的外壳蛋白基因组中,转染宿主菌后,使目的基因编码蛋白和外壳蛋白以融合蛋白的形式表达,呈现在噬菌体表面,通过一系列的筛选获得特异性噬菌体抗体分子.介绍了噬菌体抗体库技术在水产养殖过程中的疾病防控、水环境监测、水产品安全控制以及与抗体芯片结合研究等方面的研究进展.     

Cre-loxp系统在构建大库容噬菌体抗体库中的应用

以杂交瘤细胞技术为基础的单克隆抗体技术已经得到了广泛的应用,但此技术所得抗体要经过动物免疫、细胞融合以及克隆,选择周期长、过程复杂.近年来,噬菌体抗体(Phage antibody libraries)技术发展迅速,用该技术可以不经免疫即可得到大量的抗体,实现抗体的快速、大量制备.一个有效的抗体库至少要达到109的库容量,抗体库的库容量越高,抗体的亲和性越高.Cre-loxp体内重组系统可以有效增大抗体库的库容性,保证库多样性,因此为高容量抗体库的发展提供了有利的工具.本文介绍了抗体库、Cre-loxp系统以及其在构建大容量抗体库中的应用.     

T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库的构建

为筛选遗传背景清晰、裂解性能优良、宿主识别谱广泛的噬菌体用于抗菌产品开发,满足畜禽减抗、无抗养殖需求,通过易错PCR技术定向改变T7噬菌体尾丝蛋白羧基末端基因序列,并构建T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库,为筛选识别不同宿主的T7噬菌体奠定基础。提取T7噬菌体基因组,用SfiⅠ进行单酶切,回收SfiⅠ位点左侧基因组。常规PCR扩增尾丝蛋白羧基末端基因序列(TF-ct,约350 bp)以及gene17至T7基因组右侧末端基因序列(约4 000 bp)。以回收的TF-ct片段为模板,进行易错PCR扩增,将随机突变的TF-ct基因片段连接T载体,构建质粒文库。从质粒文库中用SfiⅠ/SphⅠ双酶切出TF-ct片段,并与SfiⅠ位点左侧基因组片段、gp17右侧基因组片段进行连接,利用包装蛋白拯救出T7噬菌体尾丝蛋白随机进化文库。结果易错PCR成功扩增TF-ct基因片段,并连接T载体构建质粒文库;同时随机突变的基因正确插入T7噬菌体基因组相应位置,成功拯救出尾丝蛋白定向进化T7噬菌体文库。从噬菌体文库中随机挑选15个克隆进行序列分析,目的基因的突变率在1.23%～2.16%;尾丝蛋白loop区域的氨...     

抗红斑丹毒丝菌的rSpaA蛋白猪源单链抗体库构建及单链抗体淘选

从免疫过rSpaA的猪的脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT–PCR技术反转录合成cDNA。设计兼并引物扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片段,采用重叠延伸PCR方法,将VH和VL通过Linker连接成重组单链抗体(以下简写为sc Fv)的基因片段。将sc Fv的基因连接至噬菌粒载体p Comb3Xss,将重组载体电转化至宿主菌XL1-Blue,并经辅助噬菌体M13KO7拯救,获得猪源噬菌体单链抗体库,库容约为2.5×106。以rSpaA为靶抗原,经免疫亲和筛选,获得8株特异性较好的阳性克隆。本研究结果可为制备抗红斑丹毒丝菌的重组sc Fv提供新途径,并为猪丹毒的免疫检测和综合防制提供材料基础。     

PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库的构建及鉴定

【目的】构建PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库,为研究猪源病毒与宿主细胞的相互作用奠定基础。【方法】分离纯化PK15细胞mRNA,先后合成第一链和第二链cDNA,经平末端修饰后,定向导入EcoR Ⅰ和HindⅢ接头,再由EcoRⅠ和HindⅢ双酶切消化,与噬菌体载体臂相连,然后用噬菌体包装抽提物进行体外包装,形成初级cDNAT7噬菌体展示文库,并通过滴度测定和PCR鉴定文库质量。【结果】经噬斑试验鉴定,初级文库滴度为2．0×10^5PFU／mL,扩增后滴度达6．0×10^10PFU／mL。PCR鉴定结果显示,文库的重组率为95．83％,且插入片段主要分布于500-2000bp,其中500～750bp的占21．73％,750～100bp的占21．73％,1000-2000bp的占39．13％。随机挑选20个克隆进行测序,发现均为猪源序列。【结论】构建的PK15细胞cDNAT7噬菌体展示文库具备较高库容量和重组率,质量良好,符合后续文库筛选的要求,可用于研究猪源病毒蛋白与PK15细胞的相互作用。     

猪轮状病毒VP7蛋白模拟表位的噬菌体展示技术筛选与鉴定

猪轮状病毒(Po RV)是引起仔猪腹泻的重要病原之一,其主要结构蛋白衣壳蛋白VP7可诱导机体产生中和抗体。文章以制备的抗Po RV VP7单克隆抗体(MAb)3B6作为靶分子,利用噬菌体十二肽库展示技术对其模拟表位进行筛选。四轮筛选后随机挑取阳性克隆扩增后进行ELISA鉴定,同时提取其基因组DNA测序,10个阳性噬菌体亲和肽拥有共同的外源肽序列"VPLGTDNGDIWV",而且与靶分子有很高亲和力。阳性噬菌体亲和肽与VP7蛋白进行序列比对,结果表明,十二肽中有4个氨基酸(第167位P、第178位T、第179位D和第184位W)与VP7蛋白167~184位氨基酸有一定的相似性。竞争抑制ELISA证明亲和多肽降低Po RV与抗VP7单克隆抗体之间的作用,病毒竞争抑制试验表明亲和多肽可以竞争性地抑制Po RV感染细胞。因此由这4个氨基酸构成的基序很有可能作为猪轮状病毒VP7蛋白的一个模拟表位。