粪便中华支睾吸虫虫卵DNA的提取及PCR检测方法的优化

华支睾吸虫病又称肝吸虫病,是由华支睾吸虫寄生在人或多种动物胆管内所引起的一种人兽共患病.目前,华支睾吸虫的分离鉴定主要集中在成虫或囊蚴,对虫卵的研究甚少.采用分子生物学方法成功建立了感染人粪便中华支睾吸虫虫卵DNA的提取方法及华支睾吸虫基因片段PCR检测方法,同时对PCR反应条件进行优化,为从分子水平上检测华支睾吸虫虫卵提供科学依据.     

犬细小病毒PCR诊断方法的建立及对大熊猫粪便的检测

根据GenBank中登录的犬细小病毒(CPV) VP2基因序列,设计合成1对特异性引物;以CPV疫苗株为模板,建立了一种快速检测CPV的PCR检测方法,并应用于CPV诊断.结果显示,以此对引物进行PCR扩增能得到与理论设计值大小一致的342 bp的特异性条带,对犬瘟热病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、狂犬病病毒(RV)、新城疫病毒(NDV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPV)扩增结果均为阴性;最低可检出约1.4 pg的病毒核酸;重复性试验结果表明,其检测重复性好;对45份临床宠物犬病料进行检测,并与免疫胶体金抗原检测拭纸捡测结果进行比较,吻合率为90.0％.将此方法初步应用于大熊猫粪便中细小病毒的检测,结果表明,从熊猫基地采集的52份正常大熊猫粪便样品中有8份为细小病毒阳性,阳性率为15.3％.大熊猫是通过自然感染还是弱毒苗感染细小病毒的机制还不清楚.     

大熊猫粪便皮质醇激素分布与取样对策

粪便皮质醇激素对衡量动物应激强度具有较好的指示作用,但其检测准确性受诸多因素影响。为了评估不同取样方式对大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)粪便皮质醇测定产生的影响,将粪便横向纵向四等分分割,采用冻干研筛法与酶联免疫吸附法(ELISA)处理每部分粪便和测定激素含量,旨在分析粪便激素分布情况以进一步探讨取样对策。结果显示：每部分粪便的皮质醇含量无显著差异(df=3,F=0.033,P=0.992),粪便在四等分处理下的激素分布比较均匀,即每部分粪便激素均能在一定程度上代表整体水平。1/2取样所产生的变异系数小于1/4取样,前者的检测准确性更高。粪便湿重与尺寸大小存在显著正相关性(r=0.897,P<0.001),线性回归方程为y=2.3x-29.3(y为粪便湿重,x为粪便大小,R²=0.804,F=418.846,P<0.001)。粪便干重由粪便类型、尺寸和含水率决定。在野外工作中,建议采用纵向1/2的取样对策。     

PCR方法检测奶牛粪便中鼠隐孢子虫

从含有鼠隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中,直接提取 Ｄ Ｎ Ａ 用作 Ｐ Ｃ Ｒ 模板,用 １ 对人工合成的寡核苷酸作为 Ｐ Ｃ Ｒ 引物,扩增大小为 ５４０ ｂｐ 的特异片段。 Ｐ Ｃ Ｒ 产物经电泳鉴定,表明可从含隐孢子卵囊的奶牛粪便标本 Ｄ Ｎ Ａ 抽提物中扩增出目的片段,而其他几种寄生虫及阴性对照均不能扩增出特异片段。本方法的敏感性最低可检测到含卵囊 ４００ 个／ｍ Ｌ 的样本,具有敏感性高、特异性强的特点。     

套式PCR检测奶牛粪便中隐孢子虫

为了检测样品中的微量隐孢子虫，从含有不同数量隐孢子虫卵囊的奶牛粪便中，直接提取DNA用作初始PCR（Initial-PCR）模板，以稀释的初始PCR的产物为模板进行套式PCR（Nested-PCR），用两对人工合成寡核苷酸分别作为两PCR的引物，扩增大小分别为540pb、258pb的特异片段。PCR产物经电泳鉴定，可从阳性粪便标本DNA抽提物中扩增出目的片段，而阴性对照不能扩增目的片段；初始PCR、套式PCR的敏感小生最低可分别检测到含卵囊100、5个／g粪便。初步应用结果表明某奶牛场的奶牛自然感染率为16.4％。试验表明套式PCR的敏感性比普通PCR约高100倍，能用于奶牛隐孢子虫感染情况的调查。     

大熊猫肺炎克雷伯氏杆菌的分子诊断

建立了PCR分子诊断技术 ,并对大熊猫主要肠道病原菌肺炎克雷伯氏杆菌进行检测。结果表明 ,该方法简单、快速、敏感、结果可靠 ,适用于大熊猫肠道病原菌的早期诊断 ,该方法具有广阔的应用前景。     

大熊猫粪便中纤维素降解菌的筛选及其产酶条件的优化

本试验旨在从大熊猫粪便中筛选出能够降解纤维素的菌株,并对该菌株进行鉴定和产酶条件的优化。利用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的培养基,结合碘液染色法、滤纸分解试验和纤维素酶活力测定,从大熊猫粪便中筛选得到1株纤维素降解菌DL。结合形态学观察、生理生化特征和16S rDNA基因序列同源性分析,初步鉴定该菌株为Paenibacillus cookii LZ033,它是一种产芽孢且好氧的革兰氏阳性菌。为确定菌株DL的最佳产酶条件,选取培养基初始pH、培养温度、摇床转速以及装液量4个因素,在单因素试验结果的基础上,利用正交试验,确定菌株DL的最佳产酶条件为培养基初始pH为6、培养温度为35℃、摇床转速为125 r/min、250 mL三角瓶装液量为100 mL,在此条件下纤维素酶活力(以滤纸酶活力表示)为102.3 U/mL。     

截肢拯救大熊猫

大熊猫的截肢手术未见报道.笔者在四川农业大学兽医院为一只被野兽咬伤后发生左后肢伤口严重化脓感染、胫骨远端脱位、腓骨全骨折的大熊猫;用眠乃宁麻醉后施行了截肢手术.经过37d的精心治疗和日夜监护,手术创口及全身其他所有化脓伤口全部愈合.     

大熊猫肠道疾病致病菌

对致死大熊猫的各种疾病中最为严重的肠道疾病的主要致病菌及其危害进行了综述     

大熊猫直肠脱出手术治疗1例

通过对1只发生直肠脱的幼龄大熊猫清洗、减压、手指还纳、荷包缝合等手术疗法以及输液治疗,特殊护理等措施,在短时间内使该大熊猫恢复了健康,手术取得了满意的效果.     

大熊猫和小鼠精子在获能过程中各部元素相对含量的X射线微区分析

采用扫描电镜ｘ射线微区分析方法，对获能前、后大熊猫射出精子和小鼠附睾尾精子头前、后部和尾中段Ｃａ、Ｍｇ、Ｋ、Ｚｎ、Ｃｌ、Ｐ和Ｓ等７种元素的相对含量进行了测量。统计结果表明：（１）大熊猫精子获能前头前部Ｃａ相对含量较头后部高，但小鼠精子头后部较头前部高。获能后２种动物精子头前、后部Ｃａ相对含量无显著差异；（２）小鼠精子头前部Ｃａ相对含量在获能过程中升高，而大熊猫精子头前部Ｃａ相对含量无显著变化；（３）大熊猫和小鼠精子获能过程中头部Ｋ相对含量均显著增加；（４）小鼠精子获能过程中头部和尾中段Ｓ相对含量显著升高，而大熊猫精子无这种变化；（５）大熊猫和小鼠精子相比，Ｃａ、Ｐ相对含量较高，Ｃｌ、Ｓ和Ｋ相对含量较低。本文对这些统计结果进行了讨论。     

大熊猫细管冻精制备程序的建立与应用

筛选了不同的冷冻稀释液(TEST,蔗糖-卵黄-甘油液)、不同的冷冻剂型(颗粒法,细管法)、不同甘油终浓度、不同的解冻液(M199,Ham′sF10)等条件,在此基础上,建立了大熊猫细管冻精制备程序。与传统颗粒冻精制备技术相比,本试验极显著地提高了大熊猫冷冻精液质量,冷冻精液活力从35.45%提高到57.88%(P<0.01);顶体完整率从42.25%提高到78.24%(P<0.01)。从1999年至2002年共有14只雌性大熊猫在共计36只次发情配种中采用了细管冻精,较1992～1998年采用传统颗粒冻精的总受胎率提高了11.2个百分点(达到55.6%),其中经产健康适龄雌性大熊猫的受胎率提高了27.3个百分点(达到83.3%),处女大熊猫的受胎率提高了8.8个百分点(达到58.8%)。     

山羊绒毛干中线粒体DNA和核DNA的提取与PCR扩增

本研究以PCR缓冲液、MgCl2溶液和蛋白酶K为裂解提取液,建立了一种从山羊绒毛干中快速提取DNA的方法。结果表明,该方法不仅能从山羊绒毛干中提取出线粒体DNA和核DNA,而且能够有效地进行线粒体基因和核基因组基因的PCR扩增,为拓展羊绒样品在个体识别、遗传资源评价、分子进化和分子标记辅助育种等研究领域中的应用奠定基础。     

桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA的提取及PCR反应体系优化

为了建立一套适用于桑天牛肠道细菌多样性研究的PCR反应体系和程序,采用改良的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法提取桑天牛成虫肠道细菌基因组DNA,通过L16(45)正交组合试验和单因素梯度试验对MgC l2、dNTP、随机引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA的浓度和退火温度、循环次数等影响PCR扩增的重要因素进行优化。试验结果表明,采用改良的CTAB方法提取的桑天牛成虫肠道细菌DNA质量较高,适宜于PCR扩增分析。25μLPCR反应体系及反应程序中各因素优化组合为:10×Buffer 2.5μL,MgC l22.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,随机引物0.48μmol/L,TaqDNA聚合酶0.75 U,模板DNA 75 ng;退火温度60℃,循环次数30次。     

圈养大熊猫戊型肝炎病毒感染调查

采用ELISA、巢式RT—PCR、免疫组织化学等多种方法对北京动物园保存的大熊猫组织材料和部分现存活个体的粪便、血清等样品进行戊型肝炎病毒抗原调查。调查发现在死亡大熊猫肝脏组织中戊肝病毒抗原阳性检出率为88．9％（8／9）,肾脏的阳性检出率为85．7％（6／7）。现活体动物的粪便、血清抗原检查没有出现阳性结果。结果说明死亡大熊猫曾感染过戊型肝炎病毒,现有个体中没有戊肝病毒感染。     

水貂Mustla Vison微量血DNA的提取与纯化

作者通过采取活体水貂少量血液 ( 5 0 μL) ,利用蛋白酶K消化 ,酚、氯仿法抽取DNA ,结果测量获得的数据和曲线表明 :用 5 0～ 5 0 0 μL冻存血可以获得具有一定纯度和数量的DNA ,完全可以满足RAPD分析的PCR反应所需