鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达

在大肠杆菌中表达鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV) 奉贤株的主要结构蛋白E。本研究利用RT-PCR方法扩增出E基因, 将其克隆至原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-E。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白成功获得了表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子量为63 ku。Western blot分析表明,该蛋白能与抗His标签的鼠单克隆抗体发生特异性反应。以上结果表明,在大肠杆菌中成功表达了DTMUV主要结构蛋白E。     

鸭坦布苏病毒囊膜 E蛋白的原核表达

利用 RT-PCR 方法扩增鸭坦布苏病毒分离株（WR 株）全长 E 蛋白基因,克隆到 pEASY-T3载体中,经Bam HI和XhoI酶切后将目的片段连接入pET-32a载体,构建原核表达重组质粒pET-E。表达质粒转化入感受态细胞 BL21（DE3）后,经IPTG 诱导后表达出鸭坦布苏病毒 E 蛋白,并以包涵体的形式存在,Western-blotting试验呈阳性,表明 E蛋白有很好的反应原性。     

鸭坦布苏病毒E基因的克隆表达及初步应用

利用PCR方法从鸭坦布苏病毒山东分离株(BZ株)扩增整个E基因,全长1 503 bp,克隆到pMD18-T载体中,然后将双酶切目的片段亚克隆入pET-28a(+)载体,构建出重组表达质粒PET28a-E。将PET28a-E转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导可表达出分子量约54.8 kD的蛋白,Western blotting试验呈阳性,表明E蛋白有很好的反应原性。以纯化的表达产物作为包被抗原,鸭坦布苏病毒血清为一抗,HRP标记的羊抗鸭IgG为二抗建立间接ELISA方法。采用该方法对80份送检鸭血清进行检测,并与中和试验进行比较,结果显示,两者的符合率为95.0%,表明该方法具有较好的应用前景。     

检测鸭坦布苏病毒乳胶凝集试验的建立及初步应用

以制备的鸭坦布苏病毒单克隆抗体致敏乳胶,建立检测鸭坦布苏病毒抗原的乳胶凝集方法。经优化后确定其最佳致敏抗体量为300μg、最佳致敏时间为3 h、致敏温度为37℃。以乳胶凝集试验和RT-PCR对73份自然感染病例进行检测,分别检出阳性27、31份,两者检出的阳性符合率为87.1％。本方法快速、简便,适用于基层应用。     

鸭坦布苏病毒江门株的分离鉴定及其E基因系统进化分析

从2011年江门新会区某养鸭场产蛋下降鸭群中分离出1株鸭坦布苏病毒,命名为JM株。经RT-PCR检测、透射电镜形态学观察及动物回归试验,证明该病毒是引起该场蛋鸭群产蛋下降的病原。对该病毒E基因进行序列对比、进化分析后发现,JM株与我国华东地区最早发生的鸭坦布苏病毒亲缘关系最近,核苷酸相似性达99.1%以上,表明该病毒可能来自华东地区。     

一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

2010年我国爆发了使蛋鸭产蛋量急剧下降、由一种鸭黄病毒引起的疾病,通过对来自山东某发病鸭场的病料进行分离,得到实验室分离株Du/CH/LSD/110128。对其进行全基因组序列测定分析,确定该株病毒全基因组含有一个开放阅读框,编码一个由3 426个氨基酸组成的多聚蛋白。将试验测得株Du/CH/LSD/110128株与黄热病毒(Yellow fever virus)、登革热病毒(Dengue virus)、伊利乌斯脑炎病毒(Ilheus virus)、西尼罗病毒(West Nilevirus)、巴格扎病毒(Bagaza virus)和其他一些已公布序列的坦布苏病毒进行核酸同源性比较和遗传进化树分析,发现Du/CH/LSD/110128株与巴格扎病毒亲缘关系较近但介于病毒种的水平上,与其他株坦布苏病毒核酸同源性在87%以上,可以确定Du/CH/LSD/110128株属于新型鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus)。     

浅谈鸭坦布苏病毒病

鸭坦布苏病毒病自2010年在国内首次爆发,引起产蛋鸭产蛋下降,雏鸭瘫痪,给养鸭业造成巨大的危害.通过对鸭坦布苏病毒病原学、流行病毒学、临床诊断、预防与控制等方面的阐述,为该病的诊断和防控提供参考和依据.     

鸭坦布苏病毒病的研究进展

鸭坦布苏病毒病会给养殖业带来较大的经济损失,该文简要介绍鸭坦布苏病毒病的病原、流行病学、临床症状、病理变化、诊断与防控等,以期为今后该病的深入研究和防控提供参考。     

1例雏鸭坦布苏病毒病的诊断

[目的]分析雏鸭发病原因,为临床上诊断雏鸭坦布苏病毒病提供依据。[方法]通过对发病雏鸭进行疫情调查,将采集的病料进行病毒分离,对采集的病料和分离的鸡胚尿囊液进行RT—PCR鉴定。[结果]对病料和鸡胚尿囊液进行鸭坦布苏病毒RT-PCR检测结果均呈阳性。[结论]分离的病毒是鸭坦布苏病毒,此次雏鸭发病的原因是鸭坦布苏病毒感染。     

鸭坦布苏病毒一步法RT-PCR检测方法的建立和应用

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是一种新发现可引起鸭产蛋下降的新型黄病毒,建立一种病原学检测方法对于疫病的诊断和流行病学研究具有重要意义。在对DTMUV序列的比对分析的基础上,设计了1对特异性引物,通过优化PCR反应条件,建立了DTMUV的一步法RT-PCR检测方法。该方法具有特异、快速、敏感、准确等特点,可以检出1.82个TCID50的病毒核酸。对2010年至2011年6月份前的106份产蛋下降鸭群临床病料进行了检测,结果显示样品阳性率为46.2%,表明DTMUV在浙江及其周边省份的产蛋鸭群具有较高的感染率。     

鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株的选育

【目的】将鸭坦布苏病毒BZ_2010株在SPF鸡胚上进行连续传代致弱,旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以SPF鸡胚为增殖宿主,将BZ_2010株连续传代,直至第120代,以1日龄雏鸭和30周龄的产蛋种鸭为试验对象,对第120代次毒株（命名为VC2）的安全性进行评价;以1d雏鸭为试验对象,对VC2株的返强情况进行评价;以18周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的中和抗体进行监测;以25周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的保护效果进行评价;利用RT-PCR方法分别扩增BZ_2010株和VC2株的E基因和NS4A基因,进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐缩短,而病毒毒价有逐渐提高的趋势,ELD50由第20代的10^-5.3/0.1mL提高到第120代的10^-5.8/0.1mL,而且第80代之前提高较快,后期基本稳定。将VC2株通过颈部皮下接种1d雏鸭和肌肉接种30周龄产蛋种鸭,接种后试验鸭无异常临床表现,肝脏也无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的安全性。将VC2在1d雏鸭进行连续5次传代,未发现试验鸭有任何异常症状,将第5代组织悬液接种1d雏鸭,采集肝脏进行病理切片观察,发现无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的稳定性。基因测序分析结果显示,VC2株 E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸发生改变,而NS4A蛋白只有一个氨基酸发生突变,即第54位氨基酸由F变为L。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,第4周即可达到高峰,并且维持较长时间;VC2免疫后于第2周和第50周利用强毒株进行攻毒试验,结果VC2免疫组在攻毒后未出现异常症状,粪便正常,产蛋率保持正常,这说明VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。【结论】本研究通过鸡胚连续传代成功获得了一株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,可维持较长时间。攻毒试验结果表明,VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。     

鸭坦布苏病毒E蛋白包被抗原间接ELISA方法的建立

以鸭坦布苏病毒E蛋白的主要优势抗原表位区E1蛋白作为包被抗原,建立检测鸭坦布苏病毒中和抗体效价的间接ELISA方法。优化后确定最佳的抗原包被浓度为1.548mg·L-1,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶6 000。特异性表明,用建立的ELISA方法对禽流感、新城疫病毒、1型鸭肝炎病毒、胰腺型鸭甲肝病毒、禽霍乱和鸭疫里默氏杆菌的阳性血清进行检测,均未发生交叉反应;批内和批间重复试验的平均变异系数都小于10%;敏感性达1∶3 200。该方法与以全病毒为包被抗原的间接ELISA检测结果相关性达到95.1%。利用该方法对237份来自福建省开产麻鸭的血清样品进行检测表明,其血清阳性率达77.9%,表明福建省开产麻鸭感染鸭坦布苏病毒阳性率很高。本试验建立的间接ELISA检测方法具有特异性强,重复性好,敏感性高,为鸭坦布苏病毒抗体检测提供了简单快捷的检测方法。     

抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

【目的】制备抗鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)NS5蛋白的单克隆抗体。【方法】将实验室保存的PET28a-NS5载体转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,利用纯化的鸭坦布苏病毒NS5蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴瘤细胞杂交技术结合有限稀释法制备单抗,并对单抗的特异性、反应性及其抗原表位和亚类进行鉴定。【结果】筛选获得2株稳定分泌针对DTMUV的NS5蛋白单抗的杂交瘤细胞,分别命名为A4D1和B4B8。此2株杂交瘤细胞诱导BALB/c小鼠的抗体效价均可达到1∶64 000。间接ELISA、Western blot和间接免疫荧光(IFA)检测结果表明,所获细胞分泌的抗体能与DTMUV及纯化的NS5蛋白发生特异性反应。经鉴定2株单抗的亚类均为IgG1型,通过叠加ELISA方法,初步判定2株单抗识别不同的抗原表位。【结论】成功获得了抗鸭坦布苏病毒NS5蛋白的单克隆抗体,为研究NS5蛋白的功能奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测方法的建立

[目的]建立可同时检测鸭坦布苏病毒(Duck tembusu virus,DTMUV)与鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)的二重RT-PCR,为有效防控DTMUV与DPV提供技术支撑.[方法]根据GenBank中DTMUVE基因和DPVUL6基因的保守序列,设计合成两对引物,优化反应体系条件,并通过特异性、敏感性试验评价建立的二重RT-PCR.[结果l优化后的二重RT-PCR反应体系为:2×PCR Mix 12.5 μL,其中DTMUV上、下引物各0.5 μL,DPV上、下引物各0.5 μL,混合模板2.0 μL,ddH2O补足至25.0 μL;最佳反应程序:95℃预变性5 min;95℃1 min,54.4℃l min,72℃1 min,进行35个循环;72℃延伸10 min.该方法对DTMUV与DPV的检测敏感性分别达500和600 fg,但对鸭源新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒和减蛋综合症病毒等病原体不敏感.[结论]建立的二重RT-PCR可用于DTMUV与DPV感染的快速鉴别诊断.     

鸭坦布苏病毒囊膜蛋白抗原表位的串联表达与抗原性分析

在对鸭坦布苏病毒囊膜蛋白抗原表位分析的基础上,将已经筛选出的8条抗原性良好的多肽采用柔性肽拼接,转入T载体中。将酶切回收的串联基因(命名为TEM)克隆于表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-TEM,将该质粒转化于感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导后进行超声裂解,对融合蛋白进行可溶性分析、Western blotting分析和免疫原性分析。重组质粒p ET32a-TEM的酶切和测序结果表明,TEM串联基因已成功插入到p ET32a原核表达载体中;表达的p ET32a-TEM融合蛋白分子质量约为38 000,以包涵体形式存在。Western blotting和小鼠免疫试验结果显示,p ET32a-TEM融合蛋白与鸭坦布苏病毒阳性血清能发生特异性反应,具有良好的抗原性。串联多肽的成功表达,将为鸭坦布苏病血清学检测方法建立、新型工程疫苗的研发奠定基础。     

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式(E451-dk,简称为Es)表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒(DEV)疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过"Red E/T两步重组"克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情...     

鸭坦布苏病毒竞争定量PCR检测方法的建立与应用

在现行PCR检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)方法的基础上,设计制备DTMUV竞争模板并以其为定量内标物建立竞争定量PCR(QC-PCR)体系。该体系特异性强、灵敏性高,竞争模板和目标模板可在400个分子/μL的水平上共扩增。临床应用结果表明,建立的体系能够满足简单快速确定病毒含量的要求。     

鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析

[目的]2012年10月徐州地区某鸭场的樱桃谷种鸭突然发生产蛋下降,疑似鸭坦布苏病毒病.为了确诊病因,本试验进行了剖检与病原的分离鉴定.[方法]将病料匀浆处理后尿囊腔接种SPF鸡胚,分离病毒,接种BHK细胞培养,应用RT-PCR扩增病毒全基因,测序并进行基因进化分析.[结果]分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株.该病毒株能适应鸡胚,无血凝活性,在BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU·mL-1.测序结果表明该病毒株基因组全长为10 990 nt,编码的多聚蛋白含3 426个氨基酸.DTMUV XZ-2012株与BYD株、YY5株和JS_2010株等分离株的全基因同源性为98.5％ ～99.3％.与最早分离的BYD株等相比,XZ-2012株的基因变异主要分布于E基因、NS1基因、NS2基因和NS5基因,提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力.[结论]本试验成功分离鉴定了一株鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒候选疫苗株的筛选及病毒分子流行病学研究提供了参考信息.     

不同鸭坦布苏病毒病疫苗免疫效果的比较

本研究选取鸭坦布苏病毒病弱毒疫苗(ZJ407-168株、WF100株)、灭活疫苗(ZJ407株、HB株)共4种疫苗,在实验室和鸭场对不同日龄的鸭进行免疫试验,并用间接ELISA法检测免疫后不同时期的抗体。抗体检测结果发现:弱毒疫苗免疫组在免疫后2周抗体阳性率就可达到100%,而灭活疫苗免疫组在免疫后4周抗体阳性率才达90%以上。但灭活疫苗免疫组抗体持续时间长,免疫后6个月抗体阳性率还能维持在90%以上,弱毒疫苗免疫组免疫后3个月抗体阳性率已下降至60%~70%。此外,灭活疫苗免疫组检测到的抗体D值离散差异小,而弱毒疫苗免疫组检测到的抗体D值参差不齐。本研究的结果表明,弱毒疫苗免疫组产生抗体比灭活疫苗免疫组要早14 d,但灭活疫苗免疫组检测到的抗体D值整齐,持续时间较长。上述结果可为临床防疫根据不同疫苗产生抗体的特点,合理使用疫苗,制定有效的免疫程序提供依据。