米尔伊丽莎白菌拮抗菌X2的筛选鉴定及其特性分析

本实验旨在筛选对米尔伊丽莎白菌(Elizabethkingia miricola)有抑制作用的拮抗菌,并对其生长特性及其去除氨氮和亚硝酸盐的作用进行分析。实验采用平板对峙法从“稻蛙”养殖稻田土壤中分离到1株对米尔伊丽莎白菌有较强抑制作用的菌株X2。采用形态学特征观察和16s rDNA测序对X2进行鉴定,随后对X2在不同pH、盐度、温度等条件下的生长曲线进行了测定,以评估其环境适应性,并将X2接种于氨氮和亚硝酸盐培养基中,测定去除率以评估其去除氨氮和亚硝酸盐的能力。结合形态学特征及菌株16s rDNA序列分析,X2鉴定为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)。结果显示：X2在pH 5～9、盐度5‰～50‰、温度20～40℃之间均能生长,最适pH、盐度、温度分别为7、5‰和35℃。这表明X2对环境的适应性较强,具有较强的耐酸碱性、耐盐性,适温性广等特性。X2在去除氨氮、亚硝酸盐方面也表现出了很强的能力,在X2接种浓度为5.0×10⁷ CFU/mL时氨氮的去除率最高,达到74.95%;接种浓度为5.0×10⁵ CFU...     

1株嗜水气单胞菌的拮抗菌鉴定及其特性研究

从池塘养殖的团头鲂(Megalobrama amblycephala)肠道中分离筛选出15株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)拮抗菌,其中菌株S24在平板贴片试验中对供试的嗜水气单胞菌菌株具有稳定和较高的拮抗作用。综合形态学观察、生理生化指标检测及分子序列(16S rDNA,gyrB)分析,将菌株S24确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。拮抗菌S24和嗜水气单胞菌(菌株43)的共凝集率为(36.0%±4.3%)。共培养试验可见拮抗菌S24能明显抑制嗜水气单胞菌43的增殖;共培养18 h时,嗜水气单胞菌43的细胞数量达到最低。试验结果表明,拮抗菌株S24适宜作为潜在防治嗜水气单胞菌病的益生菌。     

对虾养殖池中一株弧菌拮抗菌的分离鉴定

从对虾养殖池中分离出1株编号为2013082515(简称菌株15)的菌株,以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)为指示菌,分析了菌株15对指示菌的抑菌效果及最低抑菌浓度,同时,分析了菌株15对其他7株弧菌的抑菌效果.结果显示,菌株15对3株指示菌均具有抑菌效果,对鳗弧菌、哈维氏弧菌及副溶血弧菌的最低抑菌浓度分别为2.50×104、2.50×105、2.50×105 CFU/ml;对其他弧菌也具有一定的抑菌效果.采用注射及浸泡感染方法分析了菌株15对对虾的生物安全性,结果显示,在高浓度时,菌株15对对虾具有潜在毒性.分别用细菌全细胞脂肪酸气相色谱法和16S rDNA序列分析比对法对该菌进行分类鉴定,表明菌株15为一株假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.).     

2株水产病原气单胞菌拮抗菌的筛选鉴定及生物学特性

气单胞菌是水产养殖鱼类的重要病原菌,暂无针对多种气单胞菌感染防治的有效措施。红树林沉积物中芽孢杆菌丰富,是活性微生物的重要储库。笔者自深圳东涌红树林沉积物中筛选获得2株对6种鱼类病原性气单胞菌均具有较强拮抗活性的菌株AH10和AQ1,基于形态学、生理生化特性和分子生物学分析结果,将2株拮抗菌鉴定为解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌。生物学特性测试结果表明,2株菌的生长特性相似,最适生长温度为32℃、pH 5～7、盐度0～20。药敏试验结果显示,2株菌除对四环素耐药、对链霉素中度敏感外,对绝大多数抗生素均高度敏感。拮抗试验结果显示,2株菌除对嗜水气单胞菌、舒氏气单胞菌等6种气单胞菌具有拮抗作用外,亦均对爱德华氏菌、类志贺邻单胞菌等水产病原菌具有拮抗作用。其中,解淀粉芽孢杆菌AH10和贝莱斯芽孢杆菌AQ1分别对类志贺邻单胞菌和杀鲑气单胞菌的拮抗作用最强。生物安全试验表明,2株菌对斑马鱼和鲢均无致病性,生物安全性良好。本研究结果可为水产养殖中气单胞菌病的生物防治提供新的微生物资源,具有较好的应用前景和进一步研究价值。     

一株广温性大菱鲆肠道益生菌的筛选与鉴定

从健康的大菱鲆肠道内分离细菌,以大菱鲆致病菌鲨鱼弧菌Vibrio archariae和大菱鲆弧菌Vibrio scophthalmi为指示菌,根据拮抗作用原则,分离得到一株菌TYTG-1.根据菌株的形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析,菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.从养殖大菱鲆肠道中分离获得枯草芽孢杆茵在国内属首次报道.该株茵在4～42℃均能生长,属广温性.经过28d的投喂添加浓度为107和109CFU/g枯草芽孢杆菌的饲料,大菱鲆生长正常,未产生不良反应.该株枯草芽孢杆茵对引起大菱鲆腹水病和肠炎病的两株致病弧茵具有良好的拮抗作用,其具有较大潜力作为肠道益生菌应用于大菱鲆的养殖.     

致病性拟态弧菌的敏感药物和拮抗菌的筛选

采用纸片扩散法,系统测试了3株致病性拟态弧菌对8类23种抗菌药物的敏感性与联合用药的敏感性。结果显示:氨基糖甙类、头孢类、喹诺酮类和磺胺类等多种抗菌药物对病原弧菌均有抑制或杀死作用。庆大霉素与四环素类、头孢类、喹诺酮类、红霉素或氯霉素联用以及多粘菌素与头孢类、喹诺酮类、红霉素或氯霉素联用均表现出一定程度的累加或协同作用;同时,采用琼脂平板扩散法从9株非致病菌中筛选对致病性拟态弧菌具有拮抗作用的益生菌并对其抑菌活性进行测定。结果显示:HX-01和HX-05两株细菌的菌液和无细胞上清液对3株致病性拟态弧菌均具有拮抗作用。在拮抗菌—病原菌混合体系中,病原菌经24 h培养,菌数由原来的105CFU/mL增至2ⅹ108CFU/mL,但从第2天开始,随着拮抗菌产生的抗性产物浓度的增加,菌数快速下降,至第6天病原菌完全被杀死。而拮抗菌培养至第6天,菌数仍保持较高水平(2ⅹ107CFU/mL)。表明这两株拮抗菌对致病性拟态弧菌具有较强的拮抗作用。经数值鉴定法确定两株拮抗菌均为产碱杆菌。     

影响枯草芽孢杆菌B115抗茵物质产生的条件

产生抗菌物质的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B115能较强地抑制鲫细菌性败血症病原嗜水气单胞菌(BSK-10)及其它水生动物的致病菌，对金黄色葡萄球菌也有抑制作用．测定了不同培养基(NYDA、BPY、LB)、通气量、pH、接种浓度、营养物质及氯化钠对B115的生长及抗菌物质产生的影响和抗菌物质的稳定性，结果显示：B115培养于BPY培养基抗菌物质抑制BSK—10的作用最强；250mL三角瓶加80mL培养液。最适抗菌物质的产生；0．5％～1％的接种量，抗菌物质产生最佳；培养基初始pH7时，抑菌效价最高为18mm；葡萄糖能诱导抗菌物质的产生，镁离子、氨离子及柠檬酸钠对抗菌物质的产生没有影响，而磷酸钾和氯化钠抑制抗菌物质的产生。抗菌物质对热不稳定，其抗菌活性随着煮沸时间的延长而减弱，高压灭菌后，抗菌活性完全消失：在4℃冰箱放置15d后．活性完全消失：搞菌物后对PH不敏感．但酸性环境能使它沉淀析出。     

紫菜腐霉拮抗菌的筛选和鉴定

生物防治广泛用于农作物的病害防治,该方法在藻类病害防控方面尚未有相关的报道。腐霉(Pythium sp.)是引起紫菜(Neopyropia)赤腐病(red rot disease)的主要病原,本研究的目的是筛选和鉴定对紫菜腐霉有拮抗能力的细菌。从养殖藻类及其养殖环境中分离鉴定了385株细菌,通过平板对峙法筛选到9株对腐霉有拮抗作用的细菌,进一步通过含毒介质法筛选到3株胞外产物对腐霉具有抑制活性的细菌(P3、P6和P19)。3株拮抗菌对8株腐霉均有拮抗活性,对腐霉生长的抑制率分别为52.09%~97.95% (P3)、26.81%~78.04% (P6)、10.47%~41.91% (P19)。通过16S rRNA鉴定和多位点序列进化分析(16S rRNA-dnaA-dnaN-recA),将P3和P6鉴定为杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida),P19鉴定为解肽假交替单胞菌(Pseudoalteromonas peptidolytica)。本研究筛选得到的拮抗菌为下一步建立紫菜赤腐病的生物防治方法奠定了基础。     

弧菌拮抗菌的筛选及其效果

从健康的鱼虾体内以及养殖水体中分离得到 2 19株海洋细菌 ,以鳗弧菌 (Vibrioanguillarum)、副溶血弧菌 (Vibrioparahaemolyticus)、沙蚕弧菌 (Vibrioneresis)、飘浮弧菌 (Vibrionatriegen)等病原性弧菌为指示菌 ,在 2 2 16E平板上采用十字交叉划线法、点种法和平板扩散法进行体外拮抗实验 ,从中筛选到 6株有拮抗作用的海洋细菌。用平板活菌计数法研究拮抗菌J - 10及其胞外产物对鳗弧菌的抑菌作用 ;采用平板扩散法研究拮抗菌J- 10胞外产物抑菌效果的影响因子。结果显示 ,拮抗菌J- 10在混合体系中 ,2 4h之后表现出拮抗作用 ,在第 3天使鳗弧菌的数量降为最低 ,比第 1天的鳗弧菌数量下降了 2个数量级 ,之后鳗弧菌的数量开始上升 ,而对照组鳗弧菌的数量在第 2～ 5天基本维持第 1天的水平 ,表明拮抗菌J - 10在混合体系中具有较强的拮抗作用。拮抗菌J- 10的胞外产物能较好地抑制鳗弧菌的生长 ,使实验组的弧菌数量在 3h降为最低 ,之后呈缓慢上升的趋势 ,而对照组则一直呈上升的趋势 ;拮抗菌J - 10的胞外产物对热敏感 ,对pH的变化不敏感 ,对蛋白酶K不敏感 ,Fe3 的添加会减弱其抑菌活性。根据形态特征和常规生理生化反应进行鉴定 ,J - 10为藤黄微球菌 (Micrococcusleteus)。     

产胞外多糖的近海海洋细菌的筛选

海洋微生物是海洋生物的重要组成部分,海洋微生物可产生大量不同于陆生生物的活性物质,是重要的海洋药物资源。实验所用泥样采集于黄海近海海岸,对其进行海洋细菌的分离与纯化,获得了25株纯化的海洋细菌。采用苯酚-硫酸法和乙醇沉淀法检测这些菌株的发酵液中是否含有胞外多糖,进一步筛选出胞外多糖的高产菌株。实验结果表明,胞外多糖产量高于0．22g／L的菌株共7株,占总测定菌株数的28％,胞外多糖产量高于0．20g／L的菌株共13株,占总测定菌株数的52％。有48％的菌株胞外多糖产量介于0．19g／L和0．20g／L之间。其中以MBN003中多糖含量为最高,产量达到0．2305g／L。此研究结果表明MBN003菌株具有较高的产胞外多糖能力,可以选用MBN003作为胞外多糖提取物研究的来源。     

罗非鱼无乳链球菌拮抗株的筛选及特性研究

自吉富罗非鱼养殖池塘水体、底泥和鱼体肠道中筛选无乳链球菌拮抗株。对其中1株抑菌能力最强的菌株LT3-1进行溶血性、形态、生理生化、16S rRNA基因序列测定,并进一步对其抑菌活性与发酵时间的关系、抑菌物质对温度的耐受性、产酶性能、降解亚硝酸盐性能、药物敏感性、安全性试验、攻毒试验进行研究。鉴定结果表明,菌株LT3-1为枯草芽孢杆菌,无溶血性。液体发酵16 h时,抑菌活性最强,抑菌圈平均直径为(25.30±0.57) mm。随温度的升高抑菌活性下降,但仍然存在,说明抑菌物质有耐高温特性。枯草芽孢杆菌LT3-1具有水解蛋白、淀粉和纤维素的能力。亚硝酸盐降解试验表明,枯草芽孢杆菌LT3-1菌液密度为10^5 cfu/mL时,6 h即可将亚硝酸盐质量浓度由2.5 mg/L降至0.03 mg/L,降解率达98.8%( P <0.05)。枯草芽孢杆菌LT3-1对检测的9种抗生素均敏感,罗非鱼接种密度为10^7 cfu/mL的枯草芽孢杆菌LT3-1菌液200 μL后,仍然存活且未有异常表现。动物攻毒试验表明,添加0.05%枯草芽孢杆菌LT3-1菌粉的试验组罗非鱼存活率提高20%,显著高于对照组( P < 0.05 )。综上所述,筛选自吉富罗非鱼肠道的枯草芽孢杆菌LT3-1能有效拮抗罗非鱼无乳链球菌,可以作为防治当地罗非鱼无乳链球菌病的良好菌种资源。     

Isolation,Screening, and Identification of Proteolytic Lactic Acid Bacteria from Indigenous Chao Product

The aim of the study was to isolate, select, and identify proteolytic lactic acid bacteria (LAB) from chao, a traditional fermented fish from Pangkajene and Kepulauan Regency, South Sulawesi, Indonesia. LAB was isolated by poured plate method. Proteolytic LAB were selected using agar skim milk media. Protease activity of LAB was determined based on the amount of tyrosine released in unit/mL. Proteolytic LAB were identified using API 50 CHL kit and 16S rRNA gene sequence analysis. The result showed that a total of 60 isolates were obtained from chao, and 57% of them were cocci-shape. Fifteen isolates were halotolerant proteolytic LAB. Their R values and protease activity were 2.11–3.39 and 0.267–0.304 U/mL, respectively. Identification by API 50 CHL kit showed that four rod-shape isolates were Lactobacillus plantarum, and two others were Lactobacillus curvatus. Cocci-shape isolates could not be identified as cocci bacterium. Rep-PCR results showed that there were two kinds of bands, namely thick and thin. Two isolates were selected from two types of bands that had the highest R for the analysis of 16S rRNA gene sequences, namely Ags1-3 and Ags7-3. The results showed that Ags1-3 isolate was identified as Lactobacillus plantarum and Ags7-3 as Pediococcus acidilactici.     

4株细菌代谢产物增强鲫鱼免疫功能有效活性部位的研究

分别以蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、皮杆菌(Dermabactersp)、噬菌蛭弧菌(Bdell ovibro bacteriovorus)和蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)4株细菌代谢产物不同溶剂(石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇)的提取物腹腔注射鲫鱼(Carassius auratus),通过测定注射提取物后鲫鱼的血清凝集抗体效价、离体白细胞吞噬活性、吞噬细胞杀菌活性,研究不同代谢产物、不同提取物对鲫鱼免疫功能的影响,以确定代谢产物中活性物质的有效活性部位。结果表明:蕈状芽孢杆菌代谢产物中的活性物质主要集中在石油谜和乙酸乙酯提取物中;噬菌蛭弧菌代谢产物中的活性物质主要集中在石油醚和三氯甲烷提取物中;蜂房芽孢杆菌代谢产物中的活性物质主要集中在石油醚提取物中;而皮杆菌代谢产物中的活性物质则集中在乙酸乙酯和石油醚提取物中。试验结果为进一步追踪分离活性单体提供了基础资料。     

凡纳滨对虾养殖体系中群体感应淬灭菌的筛选、安全性评估及发酵条件优化

从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamai)养殖体系中筛选得到具有群体感应淬灭(Quorum quenching, QQ)活性的潜在功能菌,并对菌株进行16S rDNA鉴定、安全性评估及发酵条件优化。采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) A136液体X-gal法进行活性菌株筛选,发现2株细菌(BDZ5和W1B)的发酵液对信号分子己酰基高丝氨酸内酯(C6-HSL)具有显著的降解作用,但经沸水浴处理后均丧失降解活性。经16S rDNA基因序列分析,菌株BDZ5和W1B分别被鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)和科贝特氏菌属(Cobetia)。安全性评估结果显示,菌株BDZ5和W1B均无溶血性,且对多数抗生素具有敏感性,注射2株活性菌未提高凡纳滨对虾死亡率,且对凡纳滨对虾血清免疫酶活性无显著影响。单因素条件优化结果显示,在起始pH为7.0、盐度为20、0.0005%的MnCl2条件下培养48 h后,菌株BDZ5达到最大生长量;在起始pH为6.0、盐度为40、0.05%的CaCl2条件下培养48 h,菌株W1B达到最大生长量。2株菌的最适信号分子C6-HSL降解条件与其生长条件有所不同,在起始pH为7.5、盐度为30、0.0005%的MnCl2条件下培养48 h,2株活性菌对信号分子C6-HSL的降解率达到最大值。研究表明,菌株BDZ5和W1B可作为益生菌应用于水产养殖,为基于QQ角度防治对虾细菌性病害提供优良菌种。     

地榆醇提物对对虾致病菌VPAHPND生长影响及最适内参基因的筛选

为筛选适用于研究地榆(Sanguisorba officinalis L.)对对虾急性肝胰腺坏死病致病株副溶血弧菌(Acute hepatopancreatic necrosis disease caused by Vibrio parahaemolyticus, VPAHPND)抑制机理的内参基因,本文探究了地榆醇提物胁迫下VPAHPND生长的变化,并利用qRT-PCR技术探究了该条件下VPAHPND中 6种常见内参基因(rec A、pvs A、pvu A、gapdh、16S rRNA和rpo S)的表达情况,利用GeNorm、Norm Finder、Best Keeper、Delta CT以及Ref Finder这5种方法对其表达稳定性进行了评估和筛选。结果显示,地榆醇提物能抑制VPAHPND的生长,且抑制效果与浓度呈正相关。在不同浓度地榆醇提物处理条件下,这 6种内参基因扩增产物特异性良好,其中,Ct值变化差异最小的为16S rRNA (CV=3.88),变化差异最显著的为pvs A (CV=12.53)。5种方法对6种内参基因稳定性排序略有差异,其中,GeNorm给出的稳定性排序为rpo S = 16S rRNA > gapdh > rec A> pvu A > pvs A;Norm Finder结果为gapdh > rpo S > pvu A > 16S rRNA > rec A > pvs A;Best Keeper结果为16S rRNA > rpo S > gapdh > rec A > pvu A > pvs A;Delta Ct结果为gapdh > rpo S > pvu A > 16S rRNA > rec A > pvs A;Ref Finder综合排名结果为rpo S > gapdh > 16S rRNA > pvu A > pvs A > rec A。本研究根据配对变异系数结果,最终推荐同时使用rpo S和gapdh作为该条件下内参基因。本研究为以地榆为核心药物的AHPND防控技术的建立和从基因表达角度研究地榆对VPAHPND的作用机理提供了基础。     

条斑紫菜叶状体附生菌及病原菌的初步调查

对条斑紫菜叶状体进行微生态学调查,结果表明：在健康的叶状体上附着异养菌数量为106c．f.u／g,优势菌菌落为黄色和桔红色两种。具有降解琼脂特性的病原菌在健康叶状体上数量很少,它们主要附着于网绳上,这可能是引起紫菜脱落,特别是苗期严重脱落的主要原因。     

溶藻细菌的分离及溶藻特性研究

从爆发蓝藻水华的鱼池采集水样,以铜绿微囊藻为对象进行溶藻细菌筛选,得到R1、R2、R3、R5、R6、R8和R9共7株溶藻细菌,生理生化特征初步鉴定R5为海鱼弧菌,另6株为非发酵型细菌.R1、R3、R5、R8和R9细菌含量为105～108 cfu/ml时,对微囊藻的抑制率很高,效果优于R2和R6.对R1、R3、R5和R9...     

密云水库入库河流水体总细菌和反硝化菌群落组成与结构研究

研究密云水库入库河流水体中总细菌和反硝化菌的群落组成与差异性,为水库的安全管理与水质保障提供基础数据和科学依据。选择对密云水库水质影响最大的5条入库河流（潮河、白河、清水河、对家河和白马关河）,对水体中的总细菌和氮循环功能微生物反硝化菌进行了聚合酶链式反应（PCR）扩增与高通量测序分析。5条入库河流中全细菌主要隶属于6个门,而以Proteobacteria（变形菌门）为优势种群;反硝化菌在门水平的分布则相对简单,主要以Proteobacteria和少量Deferribacteres（脱铁杆菌门）构成。不同入库河流全细菌的群落结构具有空间差异,其中水文特征较为接近的白河和潮河全细菌群落结构具有较高相似性,与其他3条入库河流群落差别较大;水体中全细菌的Shannon多样性和Chao1丰富度均表现出较高水平。氮磷污染较重的对家河和潮河反硝化菌群落结构比较类似,其他3条入库河流之间则相对分散;对家河全细菌和反硝化菌的多样性和丰富度表现出较低水平。清水河水体中的全细菌和反硝化菌群落结构都较少受到已分析的环境因子影响,可能与该河道的人工改造有关。河流水体中全细菌以及关键功能微生物群落特征受到河流的水文、形态和理化指标的综合影响,可以作为水体环境与生态状况的重要指示项目,在今后的水库水环境保护与管理中应予以重视。