肠出血性大肠杆菌O157：H7主要保护性抗原单克隆抗体的研制及特性分析

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7主要保护性抗原紧密素和志贺毒素的融合蛋白。融合蛋白采用凝胶分离电洗脱法回收纯化,用纯化的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠,细胞融合后获得的3株杂交瘤细胞株1G2、3C6、1B10,能分别稳定分泌针对紧密素、志贺毒素Stx1和Stx2的单克隆抗体。3株单抗分别制备腹水并纯化,ELISA检测效价分别为1∶6.4×105、1∶1.2×106、1∶3200。Western-blot检测表明,3株单抗与融合蛋白发生特异性反应。应用3株单抗均可特异性检出EHECO157∶H7,而3株单抗与其他不产生紧密素和志贺毒素的大肠杆菌不反应。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素单克隆抗体的制备及鉴定

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素的融合蛋白。用纯化的紧密素蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经4次有限稀释法克隆,成功获得2株能稳定传代并分泌抗紧密素单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。2株单抗分别制备腹水,ELISA检测效价分别为5.2×104,2.5×104。Western blot检测表明,2株单抗与融合蛋白发生特异性反应;ELISA检测表明,2株单抗可特异性检出大肠杆菌O157:H7。本研究为建立大肠杆菌O157检测方法提供了物质基础。     

EHEC O157:H7 stx基因缺失突变株的构建及其特性

针对肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157：H7的stx基因，通过PCR扩增出缺失了183bp的s灯基因片段，将其克隆到自杀性戢体pCVD442中，然后通过接合性转导将重组自杀性质粒pCVD442：：△stx从大肠杆菌SMIO转到O157：H7中，利用抗性标记和PCR方法筛选出O157：H7 stx基因缺失突变菌株。Vero细胞毒性试验证实，该突变株不能产生完整的Stx。动物试验表明，与强毒株相比该突变株的致病性明显降低。该突变株的构建为研究志贺毒素在EHEC O157感染中所起的作用和研制O157的基因工程减毒活菌苗奠定了基础。     

饲料中肠出血性大肠杆菌O157∶H7双重PCR检测方法的建立

根据肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的O抗原编码基因rfb E和H抗原编码基因fli C分别设计引物,建立双重PCR方法。饲料样品人工污染EHEC O157∶H7后进行增菌培养,利用双重PCR进行检测EHEC O157∶H7。结果表明:建立的PCR方法能够特异性扩增出目的条带,敏感性可达到100 cfu细菌。双重PCR方法可以有效地检测出饲料中人工污染的EHEC O157∶H7,人工污染饲料样品经4 h预增菌处理后,该方法的检测下限为20 cfu细菌。本研究建立的双重PCR方法可快速、特异地检测出饲料中污染的EHEC O157∶H7,可用于饲料中EHEC O157∶H7的检测及流行病学调查。     

EHECO157∶H7stx基因缺失突变株的构建及其特性

针对肠出血性大肠杆菌 (EHEC) O1 5 7∶H7的 stx基因 ,通过 PCR扩增出缺失了 1 83bp的 stx基因片段 ,将其克隆到自杀性载体 p CVD4 4 2中 ,然后通过接合性转导将重组自杀性质粒 p CVD4 4 2∷Δstx从大肠杆菌 SM1 0转到 O1 5 7∶ H7中 ,利用抗性标记和 PCR方法筛选出 O1 5 7∶ H7stx基因缺失突变菌株。Vero细胞毒性试验证实 ,该突变株不能产生完整的 Stx。动物试验表明 ,与强毒株相比该突变株的致病性明显降低。该突变株的构建为研究志贺毒素在 EHEC O1 5 7感染中所起的作用和研制 O1 5 7的基因工程减毒活菌苗奠定了基础     

产志贺毒素大肠杆菌志贺毒素Ⅰ型双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立双抗体夹心ELISA法检测产志贺毒素大肠杆菌(STEC)Ⅰ型志贺毒素(Stx1),利用重组Ⅰ型志贺毒素A亚单位(Stx1A)免疫小鼠,制备单克隆抗体,从中筛选出非竞争性的2株单抗,构建双抗体夹心法ELISA检测方法,并对试验样品中的志贺毒素进行检测。结果显示:共获得4株针对Stx1A的单克隆抗体,分别为1H2-G7、2H1-C12、8E7-E6和2F6-F8。当8E7-E6作为包被抗体,而2F6-F8作为检测抗体时,其检测毒素的OD值最高。对样品中的Stx进行检测,表明该方法只有效识别Stx1,对Stx2不识别。结论:成功建立了用于检测Stx1的双抗体夹心ELISA法,为临床上快速诊断STEC感染奠定了基础。     

大肠杆菌O157:H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

为建立快速检测鼠感染大肠杆菌O157∶H7后的抗体,本研究采用颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG,制备金标探针,喷涂于玻璃纤维膜上;将大肠杆菌O157∶H7抗原和抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体F1分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,组装成鼠血清O157∶H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条。实验结果表明,该试纸条仅与O157∶H7阳性鼠血清发生特异性反应,用该试纸条与常规间接ELISA平行比较检测O157∶H7免疫鼠血清,抗体效价分别为1×106和1×105,两者的敏感度相当。该试纸条操作简便,10min可出结果,适用于调查与追溯鼠O157∶H7感染状况时的现场检测。     

肠出血性大肠杆菌O157:H7抗原基因及毒力基因多重荧光定量PCR检测方法的建立

根据Gen Bank公布的大肠杆菌O157:H7的菌体抗原基因rfb E、鞭毛抗原基因fli C、溶血素基因hly A、紧密黏附素基因eae A和志贺样毒素基因stx1和stx2的序列,同源性比较后选择保守序列分别设计6对特异性的引物及相应的Taqman探针,rfb E/eae A、Stx1/hly A、fli C/Stx2探针5'端分别标记为FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3'端均标记为BHQ1荧光淬灭基团。通过优化反应体系和程序,建立2个能够快速、特异性地检测大肠杆菌O157:H7及其4个主要毒力基因的三重荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度高,stx1、rfb E、fli C、eae A、hly A、stx2的最低检测限分别为20、30、20、20、30和40拷贝数/μL;特异性试验证明,该菌与其他菌种无交叉反应;重复性好,变异系数均小于2%;检测过程耗时约1 h。将建立的荧光定量PCR体系应用到人工染菌模拟猪肉样品试验中,未富集或富集8 h后测得大肠杆菌O157:H7的最低检出限分别为200 cfu/m L与1 cfu/m L。以上结果表明,本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可作为同时快速检测肠出血性大肠杆菌O157:H7及其毒力基因的方法。     

一株产志贺毒素Ⅱ且山梨醇阳性的大肠杆菌O157：H7的分离与鉴定

在上海某猪场采集6份腹泻猪粪便样品和2份病死猪小肠内容物样品,增菌后经麦康凯培养基和伊红美兰培养基分离得到32株疑似大肠杆菌,通过PCR方法分析O157特异基因rfbE和血清学鉴定,分离获得一株肠出血性大肠杆菌O157：H7。PCR检测该菌株的毒力因子携带情况,结果表明其只携带志贺毒素Ⅱ,而不携带志贺毒素I、紧密素和溶血素等毒力因子;生化试验发现该菌株与大多数O157：H7特性不同,可分解山梨醇;毒力试验和耐药性试验表明该菌株毒性较强,且耐药性很强,对大多数抗生素不敏感。     

猪水肿病大肠杆菌贵州分离株毒素Stx2e对Vero细胞的毒性作用

猪水肿病毒素即Ⅱ型志贺毒素变异体e亚型(Shiga toxin 2e,Stx2e)。采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,比较了从患水肿病猪粪便样品中分离的28株大肠杆菌所产志贺毒素对Vero细胞的毒性作用。结果显示,MTT比色法检测的细胞比活力与AO/EB染色法检测的正常细胞与早期凋亡细胞比率之和呈正相关。将28株菌株产生的Stx2e作用于Vero细胞,均能抑制Vero细胞的生长,并诱导Vero细胞的凋亡;其中8株病原菌所产Stx2e毒素对Vero细胞的毒性作用强于O157∶H7。这些毒素的毒力差异可能与其A亚基基因的结构变异有关。结果提示,贵州分离的产Stx2e大肠杆菌的毒力存在一定差异,其中部分菌株的毒力作用较强,应加强对养殖场仔猪的保护。     

检测冻肉中大肠杆菌O157∶H7的两种方法比较

大肠杆菌O157∶H7属于肠出血性大肠杆菌(en-terohemorrhagic E.coli,EHEC),是EHEC的主要血清型。感染大肠杆菌O157∶H7可使人患腹泻、出血性结肠炎,也可引发溶血性尿毒综合征及血栓形成性血小板减少性紫癜等严重并发征。笔者运用胶体金免疫(Colloidal gold immunoassay,GIA)检测卡和荧光PCR技术,对东莞市108份冻肉中的大肠杆菌O157∶H7进行了检测,并对2种方法的检测效果进行了分析比较。1材料与方法1.1材料东莞市各镇(区)冻肉库中的冻肉,共108份。大肠杆菌O157∶H7、O1、O48、沙门菌等菌株,由华南农业大学兽医学院郭霄峰教授惠赠…     

类志贺毒素II型变异体B亚单位单抗的制备和初步应用

将表达类志贺毒素II型变异体B亚单位融合蛋白的菌株ppSLT-IIeB在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达融合蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/C小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为7C3-1,制备的单抗腹水ELISA效价为210,Westernblet结果表明此单抗仅与融合蛋白反应,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测18株水肿病菌株,发现有13株产类志贺毒素II型变异体。     

屠宰环节牛羊产品中大肠杆菌O_(157)污染状况调查

初步调查分析屠宰环节529份牛羊产品中大肠杆菌O_(157)污染状况,同时对分离出的16株大肠杆菌O_(157)进行药敏试验和致病性分析。结果表明,大型屠宰场的牛羊产品受大肠杆菌O_(157)污染程度较重为4. 42%,手工屠宰场比机械屠宰场污染程度重,为4. 27%,西北方向比西南方向污染重,达到5. 08%,羊产品比牛产品污染重,为5. 91%,出场前胴体拭子比刚宰出的污染重,达到5. 84%。16株分离菌株对常见抗生素均敏感,且这些菌株都存在肠溶血素(ehx A基因)、紧密素(eae A基因)和+93 uid A毒力基因,志贺毒素(Stx1)均缺失和志贺毒素(Stx2)部分缺失。     

肠出血性大肠杆菌O157多重PCR检测方法的建立

为了建立肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157的多重PCR检测方法,本研究选取调控基因fusR与n5512,联合经典的rfbE、stx1和stx2基因,共同作为靶基因,通过对引物浓度等参数优化,建立了稳定性好的检测EHEC O157的多重PCR方法。并检测了该方法的特异性与敏感性,结果显示,该方法对非O157的产志贺毒素的大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、沙门氏菌、假结核耶尔森菌等检测均为阴性,特异性强;对EHEC基因组DNA的检测下限约为2.27×10~(-2)ng/μL,对EHEC CFU的检测下限约为104cfu/mL。对人工感染菌的样品进行检测,增菌前与增菌后的检测限分别为:饲料,4×10~3cfu/g和4×10~(-4)cfu/g;土壤,4×103cfu/g和4×10~(-2)cfu/g;牛肉,8×10-1cfu/g和8×10-3cfu/g;废水,4×103cfu/g和4×10~(-3)cfu/g。该方法还能检出感染了EHEC O157小鼠的粪便。综上,本研究建立了一种优化的EHEC O157多重PCR检测方法,为动物养殖与肉品加工过程中EHEC O157的检测提供了便捷、灵敏、可靠的技术手段。     

牛源产志贺毒素大肠杆菌分离株的毒力基因分布和遗传进化分析

为了探讨牛源产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC）分离株在毒力基因分布和遗传进化方面与人源EHEC O157菌株之间的关系,本试验选择收集来自江苏某奶牛场的STEC菌株18株以及人源、羊源、猪源、禽源STEC参考菌株9株,参照美国疾病预防控制中心PulseNet推荐的方法,运用XbaⅠ酶进行酶切并完成脉冲肠凝胶电泳（PFGE）分型和聚类分析;同时对部分STEC菌株进行毒力基因检测。结果表明,经毒力基因检测,不同来源的O157菌株毒力基因分布不尽相同,其中牛源STEC O157与参考株EHEC O157∶H7（EDL933W）的基因排谱最为相近;牛源STEC O18和O26的基因排谱与参考株EHEC O157∶H7（EDL933W）类似,但存在部分基因的缺失。对27株不同来源的STEC分离株进行PFGE,产生了22种不同的酶切图谱。总体来看,不同来源的STEC Dice相似性系数在72%~100%之间。牛源O157分离株与猪源及禽源O157菌株的相似度偏低,而与两株人源O157分离株的相似度偏高,Dice相似性系数在83%~95%之间,牛源O26（克隆群Ⅶ、Ⅷ）与人源O157的相似性系数 > 82%。显然,从牛群中分离到的部分STEC菌株与人源EHEC O157具有较近的遗传进化关系。     

类志贺毒素Ⅱ型变异体B亚单位单抗的制备和初步应用

将表达类志贺毒素II型变异体B亚单位融合蛋白的菌株ppSLT-IIeB在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达融合蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化融合蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/C小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为7C3-1,制备的单抗腹水ELISA效价为210,Westernblet结果表明此单抗仅与融合蛋白反应,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测18株水肿病菌株,发现有13株产类志贺毒素II型变异体。     

五重PCR检测大肠杆菌O157:H7菌体抗原和毒素基因

针对O157：H7大肠杆菌O抗原抗血清同多种细菌有交叉反应，而单一毒素基因并不是O157：H7所独有这一特点，建立了五重和四重PCRA-法，同时检测大肠杆菌O157：H7的O抗原、H抗原和4种毒素基因，可在较短的时间内检测、鉴定大肠杆菌O157：H7，并有较高的特异性，解决了传统细菌检测方法耗时长、灵敏度低，并有交叉反应等问题。     

志贺氏菌样毒素Stx2e缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析

水肿病是能由产志贺样毒素型大肠杆菌产生的Stx2e毒素引起的一种细菌传染病,对断奶仔猪有较高的致死率,常造成较大的经济.当前,Stx2e毒素影响病原菌与靶细胞之间的相互作用机制不明确,Stx2e基因缺失株作为后选疫苗的潜力有待确认.本研究中我们利用Red重组系统构建了大肠杆菌1522 (serotype O139:K12:H1)和1525 (serotype O157:H19)的Stx2e基因缺失株,并通过PCR检验,DNA测序手段以及Vero细胞毒性试验在细胞水平加以验证.研究发现,在同样的培养条件下,1522△Stx2e株的生长特性与原型株相比没有差异,其分解发酵糖类和氨基酸的能力也未发生改变,但是相较野生株,Stx2e基因缺失株粘附猪肠上皮细胞IPEC-J2的能力大幅度降低,可达30％.将表达K99菌毛操纵子基因克隆入1522△Stx2e中,该重组菌能够同时表达K99菌毛和自身的F18菌毛基因,且该重组株的粘附IPEC-J2细胞能力相较原型株增强近l倍.     

五重PCR检测大肠杆菌O157∶H7菌体抗原和毒素基因

针对 O1 5 7∶H7大肠杆菌 O抗原抗血清同多种细菌有交叉反应 ,而单一毒素基因并不是 O1 5 7∶ H7所独有这一特点 ,建立了五重和四重 PCR方法 ,同时检测大肠杆菌 O1 5 7∶ H7的 O抗原、H抗原和 4种毒素基因 ,可在较短的时间内检测、鉴定大肠杆菌 O1 5 7∶ H7,并有较高的特异性 ,解决了传统细菌检测方法耗时长、灵敏度低 ,并有交叉反应等问题     

检测牛奶中肠出血性大肠杆菌O157:H7的双抗夹心化学酶联免疫方法的建立

为了检测牛奶中肠出血性大肠杆菌(enterohemrrhagic Escherichia coil, EHEC)O157:H7污染,采用兔多抗作为捕捉抗体与一株O157:H7单克隆抗体作为检测抗体进行配对,构建了针对EHEC O157:H7的双抗夹心化学发光酶联免疫检测方法。该方法最低检测限可达到2.5×10~4 CFU/mL,优于ELISA检测方法,且特异性良好,与其他大肠杆菌、沙门菌、李斯特菌、阪崎肠杆菌等均无交叉反应。在用于牛奶样本的模拟添加检测中,较ELISA方法可缩短前增菌处理时间。本研究为牛奶中O157:H7污染检测提供了一种准确度高、特异性强的检测手段。