喇叭水仙中百合斑驳病毒的RT-PCR检测及序列分析

 根据基因库中已发表的百合斑驳病毒（Lily mottle virus, LMoV）外壳蛋白基因序列设计引物,通过RT-PCR方法从喇叭水仙Narcissus pseudonarcissus‘Pink-charm’ 样品中扩增出1条大小与试验设计相符的553 bp的特异性LMoV RT-PCR带。扩增产物序列分析表明：与GenBank中百合斑驳病毒百合分离物核苷酸相似性在90%以上。将该序列翻译为外壳蛋白的氨基酸序列ABW16938发现它完全存在于GenBank上已登录的LMoV病毒外壳蛋白序列NP-945145中,确认喇叭水仙该样品感染了百合斑驳病毒。     

百合斑驳病毒靖宇分离物全基因组序列测定与进化分析

以采自吉林省白山市靖宇县的野生百合感病叶片为试材，采用小RNA深度测序法检测到1株百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV),采用分段克隆方法，对LMoV靖宇分离物(LMoV-JY)的全基因组进行测定并分析，以期对吉林省百合病毒病的检测和防控提供参考依据。结果表明：LMoV-JY基因组大小为9 648个核苷酸(nt)序列(GenBank登录号MT795719),该核苷酸序列在第154～9 444位存在1个大的开放阅读框(ORF),编码1个多聚蛋白(分子量351.46 kD)。LMoV-JY与GenBank中登录的其他LMoV分离物的全基因组核苷酸序列比较，其一致性为82.82%～97.85%,在氨基酸水平上的一致性为92.96%～98.64%,其中与百合斑驳病毒大连分离物LMoV-DL(HM222521)的一致性在该2种水平上均为最高。对比LMoV-JY外壳蛋白与其他54个分离物的氨基酸序列，发现可将LMoV分离物分为2个类群。     

百合病毒检测芯片的杂交条件优化

分别以感染百合无症病毒、黄瓜花叶病毒和百合斑驳病毒的百合及感染烟草花叶病毒和马铃薯病毒Y的烟草为试材,根据5种植物病毒外壳蛋白基因保守序列设计引物和寡核苷酸探针,并制备基因芯片。用Trizol试剂盒提取感染病毒的植物总RNA,荧光RT-PCR产物与芯片杂交,研究PCR产物是否进行变性处理、杂交时间、杂交温度、杂交液组分SSC和SDS浓度及PCR体系中非荧光引物和荧光引物比例对芯片杂交的影响。结果表明:杂交适宜条件为6×SSC、0.2%SDS的杂交液、42℃杂交60min,PCR体系中非荧光与荧光引物比例为1∶10,PCR产物要进行变性处理。经过整体条件优化后的基因芯片在杂交检测上具有较高的特异性,适于检测百合病毒病。     

应用多重RT2PCR检测百合无症病毒和百合斑驳病毒

 根据病毒外壳蛋白基因序列, 设计了2对检测百合无症病毒(LSV) 、百合斑驳病毒(LMoV)的引物, 对扩增条件进行优化, 建立了同时检测LSV和LMoV的多重RT-PCR检测方法。此方法可特异地从带有LSV和LMoV的样品中扩增出2条带LSV (876 bp) 、LMoV (662 bp)。灵敏性测定结果表明, 该双重PCR可从稀释10⁴ 组织中检测出病毒, 具有与单一PCR相同的灵敏性。扩增产物测序表明, LSV扩增产物与其它分离物核苷酸同源性为87.8%～99.3%, LMoV扩增产物与其它分离物的同源性为90.1%～99.5%。     

砂糖橘上碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术对广东砂糖橘碎叶病毒的外壳蛋白(CTLV-CP)基因进行了克隆和测序分析。DNA序列分析表明,砂糖橘CTLV-CP基因的cDNA序列全长为786bp,编码262个氨基酸。BLAST分析结果显示,所得序列与苹果、梨茎沟病毒(ASGV)外壳蛋白基因及其它柑橘CTLV-CP基因的同源性在87%～91%,证明所克隆的片段为CTLV-CP基因。     

侵染节瓜的3种病毒多重PCR检测体系的建立

 根据侵染节瓜3种病毒——小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的外壳蛋白基因保守区序列设计特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,初步建立了能同步、快速、灵敏地检测这3种病毒的多重PCR检测体系,为节瓜病毒病原的检测提供了理论与技术支持。     

百合三种病毒的多重RT-PCR检测

根据基因库中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、百合斑驳病毒（Lily mottle virus,LMoV）、百合无症病毒（Lily symptomless virus, LSV）的外壳蛋白基因序列,设计了3对特异引物,通过对扩增条件进行优化,建立了同时检测CMV、LMoV和LSV的多重RT-PCR检测方法。该方法可以从带有CMV、LMoV和LSV的样品中同时扩增出3条大小与试验设计相符的657 bp (CMV) 、428 bp（LMoV）、171 bp (LSV)的特异性多重RT-PCR扩增带。扩增产物测序表明,CMV、LMoV和LSV 3种病毒与GenBank中登录的亚洲和荷兰多数分离物核苷酸同源性在90%以上,地域差异不明显,外壳蛋白序列高度保守。     

马铃薯Y 病毒河北分离物外壳蛋白基因序列分析和株系鉴定

 对河北张家口感病马铃薯的一个马铃薯Y病毒分离物( PXY-HBEI) 的外壳蛋白基因进行了克隆和序列分析。以提取的RNA为模板, 应用RT-PCR扩增目的基因, 扩增产物克隆到质粒pGEM-T, 上并序列分析。结果表明, 克隆cDNA片段由801个核苷酸组成, 编码267个氨基酸。与基因库中PVY代表株系相比, 它们的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.6%～98.8%和93.3% ～98.5% , 与PVYN 和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93.6%和97.8% , 确定PVY-HBEI归属于普通株系( PVYO株系) , 同时建立了快速、灵敏、简便的PVY RT-PCR检测方法。     

沙地葡萄茎痘相关病毒RT-PCR检测

为建立快速、灵敏、可靠的沙地葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)检测方法,以总RNA为模板,采用2组GRSPaV特异性引物对29个品种52株葡萄样品进行RT-PCR检测,并对扩增产物进行了测序和分析。结果表明,从20个品种25株葡萄样品中检测到GRSPaV,平均带毒株率为48.1%。外壳蛋白基因片段引物F1/R1从25个样品中扩增到905bp的特异片段,复制酶基因片段引物F2/R2从20个样品中扩增到498bp的特异片段,表明GRSPaV外壳蛋白基因比复制酶基因更加保守,RT-PCR检测时采用F1/R1则更为适宜。PCR产物测序结果与GenBank中登录的GRSPaV序列比较,同源性为97.90%～98.11%。     

马铃薯5种病毒多重PCR检测技术的建立及应用

采用多重RT-PCR方法,建立可同时检测马铃薯X病毒（PVX）、马铃薯M病毒（PVM）、马铃薯Y病毒（PVY）、马铃薯A病毒（PVA）和马铃薯S病毒（PVS）的方法。根据 GenBank中PVX、PVM、PVY、PVA及PVS（CP）基因序列设计特异引物,对多重RT-PCR退火温度、循环次数、延伸温度、引物组合浓度进行优化,建立了能同时检测5种马铃薯病毒的多重RT-PCR方法。该方法能同时扩增出PVX、PVM、PVY、PVA及PVS特异片段,其大小分别是138、213、369、468和657 bp。测序结果表明,5种病毒的序列与相应参考序列相似性达到97%以上。灵敏度分析结果表明,多重RT-PCR方法能够检测植物组织量为10-3 mg。应用建立的多重RT-PCR检测方法对田间样品和组培苗进行检测,结果显示,该方法可以准确、快速、灵敏地同时检测单一或复合侵染的5种马铃薯病毒。     

香蕉两种主要病毒多重PCR检测方法的建立

 根据香蕉束顶病(Banana bunchy top virus, BBTV) 和香蕉花叶心腐病(Cucumber mosaic virus,CMV) 的复制酶基因、外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对, 在BBTV单一PCR和CMV RT-PCR优化体系的基础上, 建立了可同时检测BBTV、CMV的多重PCR检测方法。此方法可以特异地从感染BBTV和CMV的样品中扩增出2条带, BBTV (748 bp) 和CMV (557 bp) 。扩增产物序列测定结果表明, BBTV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为91% ～99% , CMV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为93%～98%。     

靶向CMV外壳蛋白基因的RNA干涉在番茄中转化及表达

以CMV(黄瓜花叶病毒)外壳蛋白基因为靶标基因,针对CMV 3个常见株系(普通株系、黄化株系和坏死株系)外壳蛋白基因间高度同源序列设计引物,经RT-PCR获得目的序列,构建RNA干涉双元载体(其中目的序列反向重复插入)。以含双元载体的根癌农杆菌介导转化无菌番茄苗,培育转基因番茄。人工接种CMV验证转基因番茄抗病毒能力,荧光定量PCR分析转基因番茄中外源基因的表达效果。结果表明:RNA干涉转基因番茄呈现不同程度的抗病毒能力;对表现抗病毒能力的转基因番茄进行荧光定量PCR分析显示,转基因番茄中靶标基因的转录mRNA存在一定程度的降解,且抗病毒能力与降解程度成正相关。     

草莓斑驳病毒的RT-PCR技术检测

针对草莓斑驳病毒(SMV)基因组外壳蛋白保守序列设计特异引物,利用改进的CTAB法提取出优质的草莓斑驳病毒的总RNA,然后进行RT-PCR分子检测以期建立草莓斑驳病毒的RT-PCR检测体系。结果表明:RNA质量完好,证明改进的CTAB法应用于草莓总RNA的提取是切实可行的。     

两步多重RT-PCR快速检测苹果潜隐性病毒

【目的】为建立检测3种苹果潜隐性病毒更为快速准确的方法,【方法】以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的成龄苹果树韧皮部为试材,根据基因库中苹果茎痘病毒(Apple stempitting virus,ASPV)的外壳蛋白基因序列,设计合成了2对特异性引物,分别与合成的苹果茎沟病毒(ASGV)引物和苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的引物组合配伍,筛选出最佳的引物对组合。对cDNA的合成所用引物和总RNA模板进行遴选和量化,对PCR过程中cDNA的用量、引物对的终浓度、退火温度等主要影响因素进行优化。【结果】结果表明,反转录引物为Oligo(dT)18、总RNA 0.1～3.0μL时,可以得到较好的cDNA;ASPV-FR与ASGV-Pch、ACLSV-Pch引物组合优于ASPV-Pch,并且筛选出4组最佳的终浓度处理组合;cDNA用量为2.0~4.0μL、退火温度为50.0~52.9℃、循环数为35时,扩增效果较好。采用优化的多重RT-PCR体系对采自陕西和山东两省的样品进行检测,并用3种病毒的单重RT-PCR体系进行验证。【结论】结果呈现高度一致性,充分印证了该多重RT-PCR体系的准确性,适用于大量样品的快速检测。     

葡萄病毒B外壳蛋白原核表达及抗血清制备

根据已报道的葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR方法从葡萄中扩增获得GVB外壳蛋白基因(cp),大小为594 bp。通过序列测定和分析,选取优势分离物GVB-JFL cp基因克隆到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化融合蛋白pET-GVB CP。SDS-PAGE电泳结果显示,融合蛋白获得过量表达,分子量约26 kD。以纯化蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗血清。采用间接ELISA和dot-ELISA对抗血清特异性进行检测,结果表明,抗血清可与感染GVB的西方烟和葡萄样品发生阳性反应,与健康植株及感染同属另一种病毒葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)的样品不反应,阳性样品检测效价达1︰4 000,16个田间样品摩擦接种至烟草后有9个样品ELISA检测为阳性,表明制备的抗血清可用于GVB的特异性检测。     

苹果茎沟病毒KRL-1分离物外壳蛋白基因序列测定

以KRL-1(库尔勒香梨分离物)总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增外壳蛋白(CP)基因的cDNA片段,将其克隆到pMD18-T载体上。通过序列测定,分析结果表明:KRL-1CP基因由714个核苷酸组成,编码237个氨基酸。KRL-1与ASGV其它分离物CP基因的核苷酸同源性为90%-93%,氨基酸同源性为94%-98%。根据KRL-1与其他分离物CP基因序列和生物学症状上的差异,可推断KRL-1存在较大的分子变异。     

中国柑橘叶斑驳病毒和碎叶病毒发生状况及其分子特性研究

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)和柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)均可侵染柑橘的不同种。为明确CLBV及CTLV在中国柑橘上的发生状况和分子特性,采用RT-PCR技术对来源于中国7个省的342份和346份柑橘样品进行检测,检出率分别为9.6%和11.0%。对14个CLBV分离物和15个CTLV分离物的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因部分序列分析显示,CLBV分离物间cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为82.1%~100%和88.1%~100%,CTLV分离物的cp核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为89.5%~100%和92.5%~100%。测定的14个CLBV分离物在系统进化树中聚为2个组;而CTLV分离物分组不明显,该病毒的系统进化与寄主来源无明显关系。     

利用siRNA高通量测序和RT-PCR技术鉴定引起茄子斑驳紫花病的病毒种类

为了明确引起茄子斑驳紫花病的病毒种类,利用小干扰RNA(si RNA)高通量测序技术,结合生物信息学方法寻找茄子样本中的病毒序列,发现存在烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)和番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)。为了验证该结果,对待测样品中TMGMV和ToMMV的外壳蛋白(coatprotein,CP)全长基因进行RT-PCR扩增和系统进化分析,分别得到500bp的TMGMV-CP和482bp的ToMMV-CP特异性条带,与GenBank中TMGMV和ToMMV序列相似性分别达到98%～100%和100%,说明待测样品中确实存在TMGMV和ToMMV。对采自山东、河南、辽宁、河北等地的23份疑似斑驳紫花病茄子样品,分别采用特异性引物524-F/R和ToMMV-F/R进行检测。结果显示,所有样品中均含有TMGMV,20份样品中含有ToMMV,复合侵染检出率为86.96%。对茄子、番茄和辣椒幼苗的致病性检测显示,接种后茄子花表现出与田间相同的症状,茄子、番茄和辣椒的叶片表现典型的病毒侵染症状,在接种发病组织中检测到病毒ToMMV和TMGMV。结果表明,茄子斑驳紫花病样中鉴定出TMGMV和ToMMV两种病毒。