兔防御素基因在毕赤酵母中的串连表达及抑菌机理研究

根据毕赤酵母Pichia pastoris密码子偏爱性重编兔防御素基因(Neutrophils peptide-1,pNP-1),设计4条引物搭桥合成.将pNP-1克隆到pPICZα-A载体,使用同尾酶Xho Ⅰ和SalⅠ在重组载体上构建多价串联体[pNP-1(2×)]和[ pNP-1(3×)],分别对这3个基因进行毕...     

"自身模板引物"PCR法构建蟋蟀神经肽Grb-AST7基因串联体

[目的]通过改进的＂自身模板引物＂PCR法构建Grb-AST7基因串联体。[方法]根据蟋蟀神经肽Grb-AST7氨基酸序列设计合成2条引物,运用改进的＂自身模板引物＂PCR法进行拼接。[结果]通过拼接,获得了全长570bp、含17个拷贝的Grb-AST7基因串联体。拼接条件以拼接时间20min,25μlPCR体系中含2μl模板引物较合适。[结论]该研究为下一步进行Grb-AST7基因表达及其生物学活性分析奠定了基础。     

鸡缩胆囊素-33串联体的构建、原核表达及免疫原性研究

根据鸡缩胆囊素（choleystokinin，cck）-33基因的碱基序列及大肠杆菌高频密码子，设计了大肠杆菌表达系统偏爱的cck基因序列．将cck-33基因克隆至pRSETA质粒上，利用载体上的同尾酶构建cck基因四串联体并在大肠杆菌EcoliBL21中成功表达．将所表达的融合蛋白进行纯化后，以纯化的蛋白为免疫原制备油佐剂疫苗主动免疫胡须肉鸡．结果表明，CCK蛋白主动免疫肉鸡后，抗血清水平显著升高，P／N值远远大于2．     

YDL080 c基因缺失的低异戊醇酿酒酵母菌构建

[目的]构建YDL080c基因缺失的低异戊醇生成的酿酒酵母菌。[方法]利用Cre-lox P重组系统与酵母电转化法敲除酿酒酵母中编码类丙酮酸脱羧酶的基因YDL080c,切断酿酒酵母代谢中的异戊醇生成,从而构建一株低异戊醇生成的酿酒酵母菌株。[结果]成功构建出YDL080c基因缺失的工程酵母菌Y1,Y1酿造酒中相对异戊醇含量为0.81 g/L,比初始菌降低28.3%。[结论]利用基因敲除YDL080c的工程酵母菌能够有效减少酿造酒中异戊醇的生成量。     

基因敲除GCV2的酿酒酵母构建

[目的]构建低甲醇生成的酿酒酵母工程菌用于酿造低甲醇酒。[方法]利用基因敲除技术,敲除酵母代谢甘氨酸生成甲醇途径的甘氨酸裂解酶系的基因GCV2。[结果]成功构建出基因敲除GCV2的工程酵母L5,用L5酿造酒中的相对甲醇含量为131 mg/L,比初始菌株的192 mg/L降低31%。[结论]利用基因敲除GCV2的工程酵母菌可有效减少酒中由甘氨酸代谢生成甲醇的量。     

质粒pUC19-CM-D的构建及应用

[目的]用克隆载体pUC19构建乳杆菌自杀质粒及乳杆菌基因缺失工程菌[方法]在质粒pUC19的多克隆位点插入氯霉素抗性基因构建pUC19-CM载体;在pUC19-CM载体氯霉素抗性基因的两侧均添加1个用于同源重组的同源臂,再构建成自杀质粒pUC19-CM-D。将自杀质粒pUC19-CM-D转化乳杆菌进行抗性筛选即可得到目标基因被抗性基因替换的突变株。[结论]pUC19-CM-D质粒的构建及应用为乳杆菌基因缺失工程菌的构建提供了一个快速有效的手段,也为乳杆菌基因功能研究奠定了基础。     

多肽抗生素Apidaecin的研究进展

Apidaecin是一种新型的多肽抗生素,它具有对标受体分子的选择性识别强、对动物细胞无毒副作用等特点.文章阐述了apidaecin多肽抗生素的序列结构、生物学活性及其抗茵机制,为今后更好地利用基因重组技术生产多肽抗生素提供了有效方法.     

PGM-35Sbar玉米通用表达载体的构建及玉米转化研究

[目的]构建玉米通用表达载体,以期为利用转基因手段提高玉米对非生物胁迫的耐受性奠定基础。[方法]通过对现有的pGreen0229植物表达载体进行改造,构建含有CaMv35S启动子驱动的抗草胺膦筛选基因bar、可用于连接目的基因的玉米表达载体PGM-35Sbar,并通过花粉管通道法转化吉444玉米自交系。[结果]PGM-35Sbar玉米通用载体构建成功,转化玉米植株后,得到抗性植株14棵,经PCR检测其中有12棵为阳性植株。[结论]该研究为快速构建含有特定目的基因的玉米表达载体奠定了基础。     

弓形虫AMA1蛋白真核表达载体的构建及免疫活性检测

[目的]构建弓形虫AMA1基因的真核表达质粒,研究其在体外细胞中的表达情况。[方法]运用PCR方法和克隆技术,构建pcD-NA3.1-AMA1重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK-293细胞,用Western blotting法检测其在体外的表达情况。[结果]从弓形虫RH株cDNA中扩增出AMA1基因片段,成功构建重组表达质粒pcDNA3.1-AMA1,转染AMA1基因的HEK-293细胞表达产物经Western blotting鉴定,其分子量约为70kD,能被特异性免疫血清所识别。[结论]构建的真核表达质粒pcDNA3.1-AMA1能在HEK-293细胞中表达,为下一步弓形虫DNA疫苗的研究奠定了基础。     

基于深度学习的网络水军识别技术研究

[目的 /意义]互联网的发展带动了社交网络的快速发展,为用户提供了一个方便的信息发布、传播和接受的渠道,但其低门槛的特性也催生了一批灰黑色力量——网络水军,他们传递虚假信息,破坏网络秩序,成为互联网生态中的一大问题。[方法 /过程]本研究提出了一种基于深度学习的网络水军识别模型,结合用户的基础信息、历史言论、交互行为3方面特征,并加入了“社交亲密度”属性,通过特征提取与向量融合,利用卷积神经网络构建起水军识别模型。[结果 /结论]通过实证分析与模型对比,实验构建的模型在精确率、准确率等指标均取得了较好的效果,可以为网络水军识别提供一定技术支持与理论指导。实验表明,利用机器学习方法主动识别网络水军账号,对重点账号进行实时监管与事前防范,可以更加及时有效地避免恶性网络事件发生,降低非法势力破坏舆情生态的风险。     

HACCP在罗非鱼鱼鳞胶原蛋白多肽生产中的应用

[目的]将HACCP体系应用于罗非鱼鱼鳞胶原蛋白多肽的生产过程中,确保工业生产罗非鱼鱼鳞胶原蛋白多肽的安全性。[方法]阐述了胶原蛋白多肽的生产工艺流程,分析了各环节的潜在危害,并设定了关键限值、监控频率与措施、纠偏措施、档案记录和验证程序来监控关键点。[结果]确定原料验收、酶解提取、浓缩、喷雾干燥、磁选和内包装为关键控制点,并制定了HACCP计划表,从而在罗非鱼鱼鳞胶原蛋白生产中建立了质量安全控制体系。[结论]HACCP体系的实施降低了罗非鱼鱼鳞胶原蛋白生产中的危险因素,保障了胶原蛋白多肽的品质和食用安全。     

甘蔗14-3-3基因克隆及表达分析

[目的]克隆甘蔗14-3-3基因并预测分析其编码蛋白的结构,为研究甘蔗基因功能和代谢调控机制提供参考.[方法]以水稻14-3-3基因为模板,BLAST甘蔗EST数据库,依据序列拼接结果及RT-PCR技术获得编码甘蔗14-3-3蛋白的全长基因,并用生物信息学方法对该蛋白的二级、高级结构和功能活性位点进行预测.[结果]克隆得到长784bp的甘蔗14-3-3基因,最大开放阅读框为771 bp,编码256个氨基酸;该蛋白的分子量与理论等电点分别为28.88 kDa和4.79.蛋白聚类分析结果表明,甘蔗14-3-3蛋白与水稻、高粱、玉米14-3-3蛋白的同源性均在90％以上.Cn3D V.4.1预测位于第3和第5两个二聚体上的Lys-50、Arg-57、Arg-131和Try-132组成一个凹穴,是结合靶蛋白的作用面;第60、65、188、218位的4个丝氨酸是磷酸化的活性位点.实时定量PCR检测结果表明,14-3-3基因在甘蔗不同组织中均有表达,在茎和分生组织中14-3-3基因高丰度表达,可能与糖代谢和细胞分裂的调控相关;而在根中可能参与矿物元素的吸收和代谢.[结论]甘蔗14-3-3基因可作为信号转导调控蛋白的候选基因之一.     

百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析

[目的]克隆百日草几丁质酶的基因片段,并对其序列进行分析.[方法]以百日草“梦境”系列为材料,提取其叶片总RNA,并根据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR克隆百日草几丁质酶基因片段（ZEchi）,并对该基因序列进行分析.[结果]克隆得到的片段长度为227 bp,共编码75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明,ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源性达70％以上,其中与葡萄的同源性最高,为74％;氨基酸同源性分析表明,该几丁质酶多肽属于18家族几丁质酶,且与已报道的其他植物几丁质酶氨基酸序列具有70％以上的相似性;氨基酸聚类分析表明,该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类;生物信息学分析表明,由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白,主要含α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构.[结论]该研究为进一步研究几丁质酶基因的功能奠定了基础.     

黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达

[目的]研究黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达。[方法] 从黄河鲤脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆黄河鲤的生长激素（GH）基因cDNA,分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列。[结果] 经克隆得到的黄河鲤生长激素基因的开放阅读框包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。将GH成熟肽的cDNA扩增并克隆入表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21（DE3）表达N 端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.1 mmol/L IPTG 诱导表达的蛋白约为23.5 kD,其表达量超过蛋白总量的50%,主要为不溶性的包涵体。包涵体经尿素溶解和亲和层析,获得了单一蛋白条带。[结论]该研究克隆到黄河鲤的生长激素基因,构建其原核表达质粒,得到了高效表达的基因工程菌。     

枳早期结瘤素样基因PtBCP1的克隆和分析

[目的]克隆枳早期结瘤素样基因PtBCP1并对其序列进行分析。[方法]以枳消减文库中的C28 EST为种子序列进行电子克隆,据此设计引物进行PCR,以获得枳早期结瘤素样基因PtBCP1的全长cDNA和DNA序列,并对获得的序列进行生物信息学分析。[结果]PtBCP1基因由2个外显子和1个内含子组成,在枳幼苗根中的表达量是叶中的140倍,该基因编码的蛋白含131个氨基酸残基,预测分子量为14.0 kD,理论等电点为8.75,具有N端信号肽和PCLD(PFMD:PF02298)功能域,但无完整的铜离子结合位点,属于早期结瘤素样蛋白。[结论]为进一步研究PtBCP1基因的生物学功能奠定了基础。     

银杏HDR基因的克隆与功能分析（摘要）（英文）

[目的]获得银杏HDR基因的克隆并研究HDR基因的功能。[方法]采用RT-PCR技术获得银杏HDR的全长cDNA,命名为GbHDR（GenBank登录号：DQ364231）,该基因cDNA全长为1 827 bp,包含1 425 bp的开放阅读框,编码474个氨基酸残基的蛋白;并构建GbHDR的原核表达载体pTrcGbHDR,与原核表达载体pAC-BETA共转入大肠杆菌XL1-Blue,获得β-胡萝卜素工程菌。[结果]克隆基因实际长度为1 441 bp的GbHDR基因,该序列包含1 425 bp的HDR基因ORF,编码474个氨基酸残基的蛋白,其预测分子量为53.2 kD,等电点预测为5.76。功能互补分析表明,GbHDR能推动工程菌XL1-Blue ＋pTrcGbHDR＋pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbHDR具有典型的HDR基因功能。[结论]获得1株可高量积累β-胡萝卜素的大肠杆菌工程菌,为最终实现β-胡萝卜素代谢工程提供侯选基因和作用靶点。     

高邮麻鸭白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

[目的]对高邮麻鸭白细胞介素-2（CIL-2）基因进行克隆和序列分析。[方法]以高邮麻鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,根据已发表的鸭IL-2基因cDNA序列设计并合成1对引物,应用两步RT-PCR技术扩增出IL-2基因的特异性片段。将扩增片段插入pGEM-T-easy载体,并进行测序分析和结果验证。[结果]阳性克隆所含插入片段的DNA序列全长为433bp,与预期大小一致,含有1个423bp大小的开放性阅读框,共编码141个氨基酸的前体蛋白,N端21个氨基酸形成信号肽,成熟蛋白为120个氨基酸,分子量约为13.66kD,含1个糖基化位点。该序列与绿头鸭、绍兴鸭、固始鸭相应序列的同源性均为99.8%,与广州白鸭的同源性为99.3%,存在少量核苷酸差异。[结论]高邮麻鸭IL-2编码区基因相对高度保守,为其用于临床疾病治疗提供了一定参考。     

鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗的构建及鉴定

[目的]构建含鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK抗原基因及鸡IFN-γ基因的三价DNA疫苗。[方法]应用SOE-PCR将3-1E、CD-PK和鸡IFN-γ共3个基因通过2个（GGGGS）3连接子相连,扩增出IFN-γ/3-1E/CDPK三价融合基因,将其克隆入真核表达载体proVAX中构建三价融合真核表达质粒proIEC,后用双酶切和PCR进行鉴定。阳性重组质粒提取纯化后体外转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达情况。[结果]经双酶切和PCR鉴定证实鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗构建成功,且在PK-15细胞中获得了成功表达。[结论]鸡柔嫩艾美耳球虫IFN-γ/3-1E/CDPK三价DNA疫苗构建成功,为进一步探讨其免疫保护性奠定了基础。     

微波复合酶水解植物蛋白制取小分子多肽的研究

[目的]为了研究微波复合酶水解植物蛋白制取小分子多肽的可行性。[方法]采用微波加热和中性、酸性蛋白酶双酶复合水解大豆分离蛋白(SPI),并用高效毛细管电泳和凝胶渗透色谱等分析方法进行了验证,讨论了反应机理,还对微波和常规加热进行了对比。[结果]采用微波加热和复合酶水解蛋白质可得到小分子多肽,其分子量在2 000~8 000 Da。SPI在微波复合酶水解条件下15 min即达到了常压酸解6 h的水解度,缩短了反应时间,提高了分解效率。[结论]微波加热和复合酶水解是将蛋白分解成多肽的高效方法。