原生质体融合提高非致病性尖镰孢Fo47抗药性

选择紫外灭活和热灭活亲本原生质体为遗传标记,以非致病性尖镰孢Fo47和对西瓜枯萎菌有抑制作用的植物内生放线菌SG2、生长较快并对尖孢镰孢萎蔫专化型有抑制作用的重寄生链霉菌PR进行跨界原生质体融合,经筛选获得4株融合子F-8、F-9、F-10和F-12,皿内测定结果表明,72 h后融合子生长速率显著快于亲本Fo47(P=0.05);抗多菌灵的临界质量浓度分别达到3、9、6、6 mg/L,均高于Fo47的2 mg/L。     

非致病性尖镰孢FO47的原生质体融合改良研究

【目的】改良非致病性尖镰孢FO47的综合性状,获得具有较好防效的生防菌株。【方法】利用原生质体融合技术,将非致病性尖镰孢FO47和生防放线菌153进行融合,通过形态特征和菌落直径生长情况对融合菌株进行初筛,并采用西瓜苗期生长发育、防病效果和抗药性试验对所获得的初筛菌株进行复筛。【结果】筛选出14株菌落直径较FO47生长快的再生菌株,其中菌株F1-35、F1-38、F1-1和F1-41能够促进幼苗生长,菌株F1-35处理西瓜幼苗后单株鲜质量较FO47提高了36.93%,根长较FO47增加了19.07%。菌株F1-35、F1-38和F1-4对西瓜枯萎病的防治效果超过50%,其中菌株F1-35的防治效果最好,达到59.04%。菌株F1-4对多菌灵表现出较高的抗性,说明菌株F1-4可以与低质量浓度多菌灵混合使用防治西瓜枯萎病。【结论】筛选出3株综合性状得到提高的再生菌株,说明原生质体融合是改良生防菌株的有效手段。     

生防放线菌原生质体融合条件的研究

利用重寄生链霉菌F46与生防放线菌SC1和SC11进行原生质体融合,以原生质体的形成率和再生率为指标,研究了Gly、蔗糖、酶及其质量浓度对原生质体融合的影响,并确定了最佳的酶解时间及灭活时间。结果表明,3个菌株培养液中加入Gly和蔗糖的质量浓度以0．5和30 g／mL为宜。对菌株SC1和SC11,分别用10 mg／mL和15 mg／mL,溶菌酶酶解60 min和100 min较合适;对菌株F46,以蜗牛酶(10 mg／mL)和溶菌酶(10 mg／mL)体积比为1:1的混合酶液酶解75 min为宜。菌株F46在55℃条件下热灭活45 min,菌株SC1和SC11则需在55℃条件下热灭活15 min;菌株F46,SC1和SC11的紫外灭活时间分别为16,2和3 min。     

原生质体融合构建水稻病害生防多功能工程菌株

选取具有杀虫效果的苏云金芽孢杆菌（Bt）和抗病效果的枯草芽孢杆菌（SD）进行原生质体融合。通过对融合条件的摸索,得出Bt的最佳培养时间为5h,最佳酶解浓度为0．8mg／mL,最佳酶解时间为70min;SD最佳培养时间为5h,最佳酶解浓度为0．6mg／mL,最佳酶解时间为40min。通过检测,试验得出的融合子具备双亲的功效,     

尖镰孢枯萎病生物防治研究进展

尖镰孢枯萎病是一种毁灭性土传病害,属于对外检疫对象,其寄主范围广,可以危害100多种植物,目前主要依赖化学药剂防治。文章概述了国内外用于尖镰孢枯萎病生物防治的主要微生物种类及其生防机制的研究进展,分析了利用生防菌在尖镰孢枯萎病生物防治方面存在的问题,并提出生防菌与农药复配使用、生防菌与其它拮抗微生物协同互作、提取和纯化生防菌的抗菌物质研制新的生物农药以及构建生防工程菌等对策,以提高对病害的生物防治效果。     

生防菌FO47和FO47B10的应用研究

测定了非致病性镰刀菌FO47和FO47B10对小麦、玉米等8种作物的安全性和定殖能力,以及其对黄瓜和西瓜生长发育的影响及对黄瓜霜霉病的生物防治效果。结果表明,FO47和FO47B10对作物是安全的,并能定殖在作物体内;提前在土壤中接种FO47和FO47B10能提高黄瓜和西瓜植株的抗逆性,促进其生长发育,促生效应与其分泌的赤霉素量呈正相关关系;FO47和FO47B10对黄瓜霜霉病有明显的防治效果。     

层出镰孢菌原生质体制备条件的研究

[目的]研究层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)原生质体的最佳条件,建立高效制备层出镰孢菌原生质体制备的方法.[方法]通过对菌丝体菌龄、酶解液组合、酶解反应温度及酶解时间等影响因素进行优化,对层出镰孢菌原生质体的制备条件进行研究.[结果]菌块在CMC液体培养基中25℃培养分生孢子3 d后,过滤离心后转移至YEPD液体培养基中培养12 h,该菌丝最适于层出镰孢菌原生质体的制备;用1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/m L裂解酶、25 mg/m L崩溃酶、0.05 mg/m L溶壁酶的酶解液在30℃下对菌丝酶解1.5 h,此时原生质体的数量最大,为2.47×10~9个/m L.原生质体再生培养时,使用40%PTC溶液恢复细胞壁,在TB3液体培养基中30℃过夜培养,离心后与TB3固体培养基混合后倒入平板培养,原生质体再生率可达39.75%.[结论]通过对菌丝体菌龄、酶解液浓度、温度、酶解时间等条件的优化,可提高层出镰孢菌原生质体的产量及再生率,为进一步研究层出镰孢菌致病分子机制提供理论依据.     

利用原生质体融合技术提高杂草生防菌对野燕麦的防效

选用对野燕麦有强致病力的候选优势菌株燕麦镰孢GD 2和多孢木霉HZ 31作为亲本,采用原生质体融合技术进行菌株改良,通过野燕麦种子萌发的抑制效果及温室抑草活性作用筛选出性状优异的融合子。结果表明,获得的3个性状各异的融合子进行离体生测后,融合子R2对野燕麦种子萌发的抑制效果显著高于燕麦镰孢GD 2,而与多孢木霉HZ 31的效果相当,盆栽致病力测定时融合子R1对野燕麦的鲜质量防效值高于双亲菌株,达68.03%。选用两种不同作用机制的生防菌株作为亲本进行融合,筛选获得防效优于亲本的微生物融合菌株R1。     

人参尖镰孢菌原生质体制备条件优化及绿色荧光蛋白转化

为人参根腐病菌的侵染及防治提供可视化的检测和分析手段,通过摸索分生孢子最适萌发时间、酶解液组成、酶解温度、摇床转数及渗透压稳定剂种类,研究人参根腐病菌-尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)原生质体制备技术.结果 表明:将人参尖镰孢菌野生型菌株0083分生孢子在YEPD培养基中培养11h,酶解温度37℃、摇床转数180 r/min,渗透压稳定剂为0.7 mol/L NaC1的条件下,酶解液(崩溃酶、溶菌酶、纤维素酶和蜗牛酶质量浓度分别为0.01,0.03,0.02,0.005 g/mL)酶解0.25 g菌丝时,收获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放,共获得2.8× 107/mL原生质体.用聚乙二醇PEG介导外源DNA随机插入的方法,成功获得具有绿色荧光信号和潮霉素B筛选标记的转化子,转化效率(以单位质量的DNA的转化子数计)为1400/mg.选取转化子FOG1菌株经过6代继代培养后,菌落形态、产孢量和绿色荧光蛋白的表达与菌株0083无明显差异.因此,利用聚乙二醇(PEG)为媒介的遗传转化体系是稳定高效的遗传转化体系.     

非致病性镰刀菌Fusarium oxysporum菌株47(FO47)对番茄枯萎病的防治效果

本实验对非致病镰刀菌Fusariumoxysporum菌株47号(简称FO47)对番茄枯萎病的生物防治效果进行了初步研究。通过对峙培养和多孔细胞培养板测试以及室内盆栽试验表明,FO47在对峙培养平板上对番茄枯萎病菌无拮抗作用;施用FO47的最佳时机是番茄播种至子叶平展期,最佳施用浓度为105～108分生孢子/毫升(简写为cfu·ml-1),防效为63.6%;结果还表明FO47液体培养的过滤液能有效抑制番茄枯萎病菌孢子的萌发,抑制萌发率为81.7%。     

尖孢镰刀菌HG-11响应解淀粉芽胞杆菌B501胁迫的机制分析

前期研究发现生防拮抗菌解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B501能够显著抑制尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）HG-11，检测发现B501可以形成生物膜，具备产生纤维素酶和淀粉酶的能力。目前生物防治主要着眼于生防微生物的抑菌机制，而病原菌如何应对生防微生物胁迫的机制却常被忽略，因此旨在利用RNA-seq技术研究HG-11对B501生防胁迫响应的分子机制。结果表明，与对照HG-11样品相比，B501发酵液处理的HG-11样品中共有3 171个基因显著差异表达，其中2 106个基因上调表达，1 065个基因下调表达。上调表达有与细胞壁和细胞膜结构相关的基因如甾醇3-β-葡萄糖基转移酶基因、脂肪酸合成酶基因等，与抗氧化相关的上调表达基因有氧化物酶基因、P-P-键-水解驱动的跨膜转运蛋白基因等，以及与核糖体和线粒体相关的上调表达基因，如核糖体蛋白复合物、异柠檬酸脱氢酶等基因；下调表达的酰基转移酶基因、DNA连接酶基因等均为与细胞修复相关的基因。推测B501的抗菌物质通过破坏细胞壁及细胞膜的结构，并进入细胞内部破坏核糖体和线粒体从而抑制真菌生长。而HG-11通过调节与此相关的多个靶标蛋白或合成途径的基因表达，以缓解B501的生防胁迫作用。初步明确了尖孢镰刀菌应对生防解淀粉芽胞杆菌胁迫的基因表达差异，病原菌的自我防御机制或许是生防菌株易变表现的一个重要因素，提高了对病原菌与生防菌互作结构的认识。     

紫外线对非致病尖孢镰刀菌的诱变作用

以紫外线（λ＝２３０～２６５ｎｍ）照射非致病尖孢镰刀菌３１６菌系，随着照射时间的增加，分生孢子的存活数逐渐减少，照射时间与存活菌株对农抗１２０和速克灵的变异频率间没有一定的相关性。对农抗１２０抗性增加的菌株仍保持３１６定殖西瓜幼苗导管的能力，对瓜苗的促生作用以及非致病性。在药板上用紫外线重复照射存活菌株后，获得的菌株对两种农药的变异频率均有提高，对农抗１２０的抗性有所下降，对速克灵的抗性显著提高。     

一株拮抗美洲南瓜枯萎病菌的内生真菌N-1的鉴定及其生物学特性

为明确内生真菌N-1菌株对美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用及其分类地位,探索其防治植物病害的潜能,采用平板五点对峙培养法、生长速率法和防效盆栽试验测定N-1菌株对美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用;结合形态学特征和rDNA-ITS序列分析对N-1菌株进行鉴定,并研究其生物学特性。结果表明,内生真菌N-1菌株对美洲南瓜枯萎病菌具有较强的抑制作用,对峙培养5 d菌株N-1对美洲南瓜枯萎病菌的抑制率为75.93%,发酵液原液对该病菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制率分别为70.94%和82.87%,室内盆栽相对防效为76.41%。通过形态学和rDNA ITS序列分析,将菌株N-1鉴定为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)。该菌株最佳生长培养基为SDAY培养基,最适生长温度为35℃,最适生长pH为7,可利用的最佳碳源和最佳氮源分别为葡萄糖和酪氨酸。研究表明,内生真菌N-1菌株具有潜在的生防价值,可为美洲南瓜枯萎病生防菌剂的研发提供新的菌种资源。     

尖孢镰刀菌侵染枸杞根系的转录组分析

由尖孢镰刀菌引起的根腐病是枸杞种植中的主要病害之一,为探究尖孢镰刀菌侵染枸杞的分子致病机制,并挖掘其关键致病基因,通过尖孢镰刀菌侵染‘宁杞1号’枸杞根系,于侵染第7天刮取菌样进行转录组测序分析。结果表明,与纯培养菌株相比,在侵染第7天的尖孢镰刀菌中共发现了1 892个显著差异表达基因,其中上调表达基因1 242个,下调表达基因650个;GO富集分析表明,分子功能分类的跨膜转运蛋白和ATP酶活性以及生物学过程分类的跨膜转运可能在尖孢镰刀菌致病过程中发挥了重要作用;KEGG富集分析表明,鞘脂代谢、过氧化物酶体和ABC转运蛋白是尖孢镰刀菌侵染过程的主要代谢途径。此外,通过对比分析编码碳水化合物酶与植物-病原互作相关基因在尖孢镰刀菌侵染前后的表达量,筛选到10个关键致病候选基因。     

枯草芽孢杆菌对百合枯萎病的防治效果

采用菌丝生长速率法及孢子萌发法,研究枯草芽孢杆菌对百合枯萎病菌的抑杀效应。枯草芽孢杆菌无菌滤液在一定体积分数范围内能有效抑制枯萎病菌菌丝生长,减少孢子萌发,且随着无菌滤液体积分数的增加,孢子萌发抑制率也增大。体积分数为20%的枯草芽孢杆菌无菌滤液,处理后7d抑制率可达78.8%。体积分数为60%时,可完全抑制孢子萌发。盆栽防治试验表明,枯草芽孢杆菌菌液对百合枯萎病的发病抑制率达65.3%。且该菌液对百合的生长有一定的促生功效,说明枯草芽孢杆菌对百合枯萎病有抑菌和防病作用,且抑菌作用随枯草芽孢杆菌菌液体积分数的增加而增强。     

防治植物枯、黄萎病的优良放线菌株筛选

采用平板对峙法、生长速率法和组织研磨法对实验室前期获得的放线菌进行测定,以期筛选出对植物枯、黄萎病生防作用较为全面的优良放线菌株。皿内抑菌试验结果表明,菌株SC11的抑菌能力最为突出,对3种靶标菌的平均抑制率接近80%,菌株153、SE2和F46也有较好的抑菌效果,平均抑菌率均超过50%;耐药性试验结果表明,菌株153、SC11耐药性较强,菌株F46在各杀菌剂存在条件下均不能生长;盆栽试验结果表明,菌株153、SC11在不同作物上均有较强的定殖能力,对供试作物种子萌发及植株生长有明显的促进作用。经室外盆栽模拟大田试验证明,153、SC11放线菌具有较好的防病促生效果。总体来看,菌株153和SC11的生防特性较全面,抗菌、耐药、易定殖并且能够促进作物生长,具有一定的应用潜力。