玫烟色棒束孢几丁质酶(Ifuchit2）结构基因 及上游序列的克隆与分析

玫烟色棒束孢作为一类可致昆虫死亡的虫生真菌,是生物防治中极具开发应用潜力的种类。运用PCR技术与DNA步移技术,从玫烟色棒束孢中克隆得到几丁质酶的结构基因及其上游序列。结构基因总长1 425 bp,扩出的结构基因DNA与其cDNA比较含有3个内含子,分别位于距离起始密码子的121碱基至176碱基处,277碱基至331碱基处和380碱基至431碱基处,大小分别为54 bp、53 bp和51 bp。在玫烟色棒束孢几丁质酶Ifuchit2结构基因的基础上,克隆得到了其上游序列。该基因上游序列大小为1 794 bp,其中有209 bp与该基因cDNA序列相互重叠。序列分析表明,玫烟色棒束孢几丁质酶Ifuchit2上游序列中,含有真核生物基因典型的TATA-盒,以及多个高度保守的潜在转录因子结合位点,如Oct1、GATA-1、GATA-2和CdxA等。另外,该上游序列还存在一些特异的应答元件,如热激应答元件(HSE)、胁迫应答元件(STRE)等。     

虫草棒束孢类枯草杆菌蛋白酶基因克隆及分析

采用逆转录PCR方法克隆获得1个虫草棒束孢类枯草杆菌蛋白酶基因的开放阅读框(ORF)序列,并对其进行生物信息学分析。该基因的开放阅读框全长1 599bp,编码的蛋白质由532个氨基酸组成(包括18个氨基酸的信号肽)。预测蛋白质的等电点和分子量大小分别为6.256、56.936 ku。进行序列分析和进化树构建,发现该蛋白酶与已知的几个种类枯草杆菌蛋白酶具有很高的同源性,且与虎甲寄生菌的粉拟青霉位于同一进化分支。实验首次鉴定了虫草棒束孢类枯草杆菌蛋白酶基因的编码区序列,为进一步研究虫草棒束孢致死蝙蝠蛾幼虫的作用机理提供理论依据。     

WRKY35转录因子的cDNA克隆与植物表达载体的构建

文章以丁香假单孢菌处理的哥伦比亚型拟南芥为植物材料,利用RT-PCR技术获得了拟南芥WRKY35转录因子的cDNA编码序列。序列分析表明,WRKY35核苷酸序列长1363bp,CDS全长1314bp,编码438个氨基酸,含有一个典型的WRKY结构域,具有WRKY转录因子的典型特征。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pBI121中,成功构建了拟南芥的WRKY35基因的植物表达载体,为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。     

鹰嘴豆LHY基因cDNA克隆及生物信息学分析

从鹰嘴豆中克隆生物节律钟LHY基因的cDNA全长序列,进行序列信息学分析。通过同源克隆策略,利用RT-PCR技术获得核心片段,结合5＇-RACE和3＇-RACE技术,克隆得到鹰嘴豆生物节律钟基因LHY的cDNA全长序列,其核苷酸序列长度为3 061 bp,包括2 220 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码739个氨基酸。验证后命名为CarLHY基因,获得基因登录号为KJ558378。生物信息学研究表明CarLHY基因cDNA序列与其他植物LHY基因具有较高的相似性;预测CarLHY蛋白不具有跨膜结构;为转录因子,定位于细胞核中;不具备信号肽。对CarLHY蛋白功能结构域预测表明,蛋白质核心结构存在符合转录因子与DNA结合的常见功能域HTH。蛋白系统进化树显示,与大豆分子进化距离最近,其次是黑杨、拟南芥。     

偏肿革裥菌漆酶基因克隆及启动子序列分析

以优化后的漆酶培养基为基础,通过RT-PCR和RACE技术相结合,从偏肿革裥菌 Lenzites gibbosa 菌株中获得编码漆酶基因的cDNA及Genomic DNA的全长序列,Genomic DNA大小为2 165 bp.通过比较该漆酶基因的cDNA和Genomic DNA的全长序列,发现该基因包含11个外显子和10个内含子.cDNA序列的全长为1 873 bp,其中包含一个完整的ORF,长度为1 563 bp,编码520个氨基酸.序列在氨基酸水平上与彩绒革盖菌 Trametes versicolor 的相似性评价最高,相似性达83%.通过SEFA-PCR的方法,扩增得到漆酶基因起始密码子上游长986 bp的启动子序列.分析表明,该启动子区域上除分布有TATA-box、CAAT-box以及AP2等基本的转录起始元件外,还存在有多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括7个MRE元件、2个STRE元件、1个HSEs元件、7个氮因子结合位点等.这些结果表明,不同的外源诱导物可以调节偏肿革裥菌漆酶基因的表达.     

红平菇HP1漆酶基因及启动子克隆和序列分析

以优化后的漆酶培养基为基础,将RT-PCR、RACE技术相结合,从红平菇菌株中获得漆酶基因cDNA全长及Genomic DNA全长序列,Genomic DNA大小为2 344 bp。通过对漆酶基因cDNA全长和Genomic DNA全长序列的比较,结果显示该基因包含13个外显子和12个内含子。基因cDNA全长为1 746 bp,其中包含1个完整的ORF,长度为1 590 bp,编码529个氨基酸。序列在氨基酸水平上与桃红侧耳Pleurotus salmoneostramineus的氨基酸序列具有较高的同源性,相似性达97%,与齿耳菌Steccherinum murashkinskyi漆酶氨基酸序列相似性达到72%。通过SEFA-PCR的方法,扩增得到漆酶基因起始密码子上游长1 126 bp的启动子序列。分析表明,该启动子区域上除分布有TATA-box、CAAT-box、AP2等基本的转录起始元件外,还存在多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括4个MRE元件、2个CreA热击元件、2个STRE元件、1个NIT2元件、1个HSEs元件、1个XRE异生物质反应元件、4个氮因子结合位点等。不同外源诱导物可以调节红平菇HP1漆酶基因的表达。     

基因组步行法扩增Artemin基因上游调控序列

为克隆artemin基因上游调控序列,探明该基因表达的调控机理,分别用4种不同的具有平末端的限制性内切酶消化卤虫基因组DNA,然后与DNA接头连接,构建成无载体连接的卤虫Genome Walker DNA文库．利用基因组步行法,经2轮TD—PCR扩增出长度约750bp的artemin基因上游调控序列片段,扩增产物测序后得到2个长度分别为209bp和210bp的序列．序列分析表明：在3’—末端片段中,存在转录起始位点“TTATTT”,TATA框位于-32～-38,CAAT框则位于-75～-78．此外,在这两个片段中还存在一些潜在的TFIIB识别元件,GC盒,AT富含元件,这些元件对于该基因的转录具有一些潜在的调控作用．     

蝉拟青霉类枯草杆菌蛋白酶基因的克隆及其序列和蛋白质分析

蝉拟青霉是一种常见的昆虫病原真菌,被广泛应用于生物防治。本研究根据GenBank中已登录的淡紫拟青霉、粉拟青霉、球孢白僵菌和金龟子绿僵菌的类枯草杆菌蛋白酶基因序列的同源性比较,以它们高度保守的核苷酸序列设计一对引物,采用RT-PCR和3'/5'-RACE相结合的方法,从蝉拟青霉中克隆出完整的类枯草杆菌蛋白酶(subtilisin-like protease)cDNA基因序列。cDNA全序列为2 031 bp,该序列5'-端和3'-端的非编码序列长度分别为170 bp和262 bp,开放阅读框为1 599 bp,编码532个氨基酸,信号肽长度为18个氨基酸,前肽长度为133个氨基酸。该基因编码的蛋白序列与虫草棒束孢(Isaria farinosa)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、蛹虫草(Cordyceps militaris)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)类枯草杆菌蛋白酶有较高的同源性,同源性分别为88%、88%、89%和71%。成熟蛋白具有典型的丝氨酸蛋白酶活性位点,同时有5个半胱氨酸,4个潜在的N-糖基化位点,位于细胞的液泡中与分泌途径相关,二级结构中以α-螺旋和无规则卷曲为主。     

棉花转录因子基因GhMS3的克隆及其启动子功能的鉴定

【目的】从棉花无短绒突变体GZnn中分离棉纤维发育相关的转录因子,并对其转录激活功能和表达模式进行初步分析。【方法】通过RACE(rapid amplification of the cDNA ends)和染色体步行(genome walking)技术,获得GhMS3的cDNA序列及基因组DNA序列。利用生物信息学方法对获得的DNA序列及推定的氨基酸序列进行分析,采用酵母单杂交系统验证GhMS3蛋白的转录激活功能,运用GUS组织化学染色法在转基因烟草中分析该基因的表达模式。【结果】获得GhMS3的基因组DNA以及上游1174bp的启动子序列。氨基酸序列比对发现GhMS3是R2R3 MYB转录因子。酵母试验表明,GhMS3蛋白具体外转录激活功能,C端体外转录激活功能较强,在PGhMS3:GUS转基因烟草中,GUS主要在表皮毛、根毛以及细胞分裂旺盛区域表达。【结论】从棉花无短绒突变体GZnn中分离到的R2R3 MYB转录因子GhMS3,具有组织特异性表达模式并且其编码蛋白具有体外转录激活功能,是否参与植物表皮细胞分化有待于进一步研究。     

西农萨能羊脂肪酸合酶(FASN)基因启动子序列的克隆与序列分析

以陕西省千阳县种羊场的足月正常分娩、健康的西农萨能羊为试验材料,运用PCR方法对其FASN基因启动子部分序列进行了克隆和序列分析,获得了西农萨能羊FASN基因启动子序列片段719 bp(GenBank收录号EF556550.1).序列分析显示,TATA盒位于-35 bp处,1个类似于CAAT盒的序列位于-68 bp处,这些都是典型的真核生物启动子元件,TATA盒上游区域有76％以上的G/C含量和4个GC盒(GGGCGG和CCGCCC),潜在的核转录因子结合位点Sp1位于-99 bp、-174 bp、-255 bp和-320 bp.     

镰刀菌rDNA ITS序列的克隆及序列分析

[研究目的]为了利用rDNA ITS区的遗传变异的特点,为镰刀菌种内及种间的分类鉴定提供一定的分子技术辅助手段,[方法]试验以PMD18-T为栽体,对10个不同镰刀菌菌株的rDNA的ITS区及28S部分片段进行了克隆、测序,用DNAMAN4.0软件进行序列分析,分析了菌株间的同源性及遗传距离,并建立了分子系统进化树.[结果]试验结果表明:所测各菌种间的亲缘关系在92.2%～99.9%之间,反映了种间较大的遗传差异,这与形态学上把它们鉴定为不同的种相吻合,而从不同地区、不同寄主上分离的同一菌种的不同专化型,其同源性高达96.6%～100%,说明同一菌种的不同专化型,在rDNA基因序列上碱基差异甚微,同源性很高.[结论]利用ITS对镰刀菌进行种间的分类鉴定是稳定可行的,但对于种内及专化型的鉴定存在困难.     

越橘EST-SSR分子标记的开发及其遗传多样性分析

【目的】探讨越橘EST序列中SSR位点的分布规律,开发越橘EST-SSR引物,并分析其在越橘品种遗传多样性研究中的作用。【方法】以91份越橘种质为材料,利用越橘果实转录组(RNA-Seq)的测序结果,通过SSRIT在线搜索,利用Primer Premier 5.0软件设计30对引物,并筛选扩增效果理想的引物,用筛选出的引物分析91份种质的多态性,构建91份种质的系统发育树。【结果】34 464条越橘unigene序列中含有SSR位点的序列有829条,SSR位点有913个,其中二核苷酸、三核苷酸重复是主要的SSR类型,分别占全部SSR位点的13.69%和81.27%。不同核苷酸数目重复基元的重复次数差异很大;越橘EST-SSR位点集中在11~15bp;三核苷酸和六核苷酸重基元复种类最多,在所有重复基元中GAA/TTC发生频率最高。设计的30对引物中有17对引物在供试越橘种质中扩增出理想的PCR产物,17对引物均有多态性。聚类分析结果显示,在遗传相似系数为0.69时,可以将供试越橘种质分成4组。【结论】EST-SSR标记可以用于越橘品种的鉴定与遗传多样性分析。     

野生大豆CDPK基因保守区的克隆及序列分析

CDPK(Ca2+-dependent,calmodulinindependentproteinkinase)是植物钙信号传导过程中关键的蛋白激酶,在逆境胁迫信号传导过程中起到重要作用。研究基于同源序列候选基因的策略,根据已经公布的多个CDPK序列的比对结果,在保守性较高的区域,设计两对巢式简并引物,结合降落PCR和巢式PCR在野生大豆中克隆。对获得的序列片段进行序列分析,发现该序列具有激酶活性的功能区域和CDPK特有的EF手性结构区,并且与VrCDPK(U08140)序列达到94%的相似性,可以确定该片段是CDPK基因的保守序列。结果证明,野生大豆中也存在CDPK基因,并为通过RACE等方法获得野生大豆全长CDPK基因奠定了基础。     

人Neurturin基因的克隆及序列分析

文章以人胎脑cDNA为模板,采用巢式PCR方法扩增人Neurturin成熟蛋白基因,并将其插入到质粒pGEM-T,构建克隆载体pGEM-T-hNTN。对阳性重组子进行鉴定和序列测定,并与已克隆的人Artemin成熟蛋白基因进行同源性分析。结果表明,所克隆DNA片断与文献发表序列(GenBank NM004558)完全一致,人Neurturin成熟蛋白基因与Artemin同源性为58.5%。     

牦牛PIT-1基因第5、6外显子部分序列的克隆测序

利用PCR方法扩增了麦洼牦牛PIT-1基因第5、6外显子的部分序列,扩增片段长度为1 285 bp,克隆到PND-18载体中进行测序,结果牦牛与普通牛的PIT-1基因有97%的同源性,共有28处不同,其中在内含子5的347处有18个碱基的缺失,565处有4个碱基的插入;外显子6有一个碱基突变,并导致氨基酸由普通牛的Thr变为牦牛的Arg。对61头麦洼牦牛和30头九龙牦牛PIT-1基因部分序列进行PCR-RFLP分析,均未检测到多态性。     

Large-scale and automated DNA sequence determination

DNA sequence analysis is a multistage process that includes the preparation of DNA, its fragmentation and base analysis, and the interpretation of the resulting sequence information. New technological advances have led to the automation of certain steps in this process and have raised the possibility of large-scale DNA sequencing efforts in the near future [for example, 1 million base pairs (Mb) per year]. New sequencing methodologies, fully automated instrumentation, and improvements in sequencing-related computational resources may render genome-size sequencing projects (100 Mb or larger) feasible during the next 5 to 10 years.     

辣椒疫霉EST-SSRs标记的发掘

通过对GenBank上发布的55 848条辣椒疫霉EST的鉴定,在328条EST中发现331个SSR.在筛选的EST序列中SSR平均密度为每23.7 kb含有1个SSR.在鉴定的SSR中,三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占鉴定总数的59.5%;其次为二核苷酸乖复基元的SSR类型,为39.3%;四核苷酸重复基元的SSR类型最少,为1.2%.设计40对SSR引物对5个辣椒疫霉菌株基因组DNA进行PCR扩增,有27对引物扩增出SSR特征条带,其中有18对引物在5个辣椒疫霉菌株间扩增出多态性条带25条.基于SSR标记进行聚类分析,可将5个检测大豆疫霉菌菌株划分为3类.该研究是辣椒疫霉的SSR标记开发的首次报道,为辣椒疫霉的遗传变异和分子作图等分析提供了一种有效的分子标记系统.