牛β-酪蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

以牛β-酪蛋白标准品为免疫原,免疫健康的新西兰大白兔,制备了兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体。经亲和层析纯化后,用SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测抗体的纯度,经ELISA法测定β-酪蛋白抗体的效价为1∶1600。Western-blot分析发现,制备的抗体与β-酪蛋白可以发生特异性结合,表明成功制备了纯度较高和特异性较好的牛β-酪蛋白多克隆抗体,为乳腺生物反应器的研究提供了有效的工具。     

牛β-酪蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

以牛β-酪蛋白标准品为免疫原,免疫健康的新西兰大白兔,制备了兔抗牛β-酪蛋白的多克隆抗体。经亲和层析纯化后,用SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测抗体的纯度,经ELISA法测定β-酪蛋白抗体的效价为1∶1600。Western-blot分析发现,制备的抗体与β-酪蛋白可以发生特异性结合,表明成功制备了纯度较高和特异性较好的牛β-酪蛋白多克隆抗体,为乳腺生物反应器的研究提供了有效的工具。     

奶牛α_s-酪蛋白多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

本试验旨在制备高纯度和特异性的奶牛αs-酪蛋白多克隆抗体,为鉴定奶牛乳腺合成的αs-酪蛋白提供试验材料。选用4只健康新西兰大白兔,每2周免疫1次奶牛αs-酪蛋白,待血清达到抗体效价后,对兔进行颈动脉放血并分离血清,利用饱和硫酸铵法和蛋白A树脂纯化抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)法分别用于鉴定纯化后抗体的纯度和特异性。结果表明,经过饱和硫酸铵法和蛋白A树脂2步纯化后得到了纯度较高的抗体,同时可以特异性结合奶牛αs-酪蛋白。本试验制得的抗体可以用于鉴定奶牛乳腺合成的αs-酪蛋白,为进一步研究奶牛αs-酪蛋白合成的调控提供了有效的科研材料。     

非洲猪瘟病毒p54抗原C端的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

利用大肠埃希菌表达非洲猪瘟病毒核心抗原p54蛋白C末端55个氨基酸的肽段(命名为p54-2),制备了多克隆抗体并进行了纯化,以进一步用于非洲猪瘟ELISA试剂盒的研发。将PCR扩增获得的p54-2目的片段与表达载体pGEX6p-1质粒均经过限制性内切BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建pGEX6p-1-ASFV-P54-2原核表达质粒。将该质粒转化到大肠埃希菌BL21中,诱导蛋白大量表达,并纯化获得高纯度的蛋白。将纯化的p54-2蛋白免疫小鼠,获得p54-2多克隆抗体并进一步纯化多抗。用ELISA、Westernblot对纯化的多克隆抗体进行效价滴定及特异性鉴定。结果显示,成功构建了pGEX6p-1-ASFV-P54-2重组质粒,在大肠埃希菌中IPTG诱导下,能够高效表达重组p54-2蛋白。用p54-2蛋白免疫Balb/c小鼠获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶128000,说明该蛋白有很好的免疫原性。Westernblot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别非洲猪瘟病毒p54胞内区,具有较高反应性和特异性,可以用于ELISA检测方法研究和p54抗原表位的鉴定。     

人参皂苷Re多克隆抗体的制备

为了制备半抗原人参皂苷Re的特异性多克隆抗体,用过碘酸钠法构建了Re和牛血清白蛋白（BSA）的偶联物作为抗原,分5次免疫新西兰大白兔、取免疫前的新西兰大白兔血清作为空白对照,第5次免疫后采取血清,通过酶联免疫法（ELISA）鉴定血清中Re多克隆抗体的效价,再用竞争性抑制法检测抗体的灵敏性和特异性。,结果表明,抗原Re—BSA偶联物制备成功,第5次免疫后,抗体的效价达到1：40960,与其他人参皂苷交叉反应率低于2％,特异性强,可用于人参皂苷Re的检测。     

牛结节性皮肤病病毒p32蛋白膜外区可溶性表达及多克隆抗体制备

为获得牛结节性皮肤病病毒(LSDV)p32可溶性蛋白并制备其多克隆抗体,截取了LSDV的P32基因膜外区序列,并构建了重组表达质粒pColdⅠ-P32,在大肠埃希氏菌BL21(DE3) pLysS细胞中经低温诱导表达,然后用钴离子亲和层析纯化以可溶性形式表达的重组蛋白,使用纯化的p32截短蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,并通过Western blot鉴定。结果表明,成功使用钴离子亲和层析纯化获得LSDV p32可溶性膜外区蛋白,制备的多克隆抗体可以特异性识别LSDV感染的牛组织蛋白。获得的纯度较高的LSDV p32截短蛋白和特异性良好的多克隆抗体,为建立LSDV抗原检测方法及亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

塞内卡病毒多克隆抗体的制备及其在免疫组织化学中的初步应用

为了制备纯度高、特异性强的塞内卡病毒(SVA)多克隆抗体并研究其在免疫组织化学(IHC)中的应用，本试验用甲醛溶液灭活SVA,将其与矿物油佐剂充分混合乳化后，接种兔制备多克隆抗体并测定中和抗体效价，经Protein A亲和层析介质纯化，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定抗体纯度，用斑点杂交法(Dot blot)鉴定抗体特异性；以该抗体作为一抗，应用IHC技术检测SVA感染猪的蹄部组织切片中抗原的表达情况。结果显示，制备的SVA多克隆抗体中和抗体效价为1∶1 024,纯化后的抗体经SDS-PAGE鉴定仅有分子量约55 kDa和25 kDa两条目的蛋白条带；Dot blot结果显示，该抗体特异性强，最低检测浓度为0.15μg/mL;IHC结果显示，该抗体在1∶500稀释时能够检测到组织切片中抗原的表达。结果表明，本试验制备的SVA多克隆抗体符合IHC技术要求，可为下一步SVA致病机理研究提供重要的试验材料。     

鸭MHCⅡβ基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

据NCBI上已发表的序列设计引物,通过RT—PCR从北京鸭脾脏的总RNA中扩增得到MHCⅡβ基因,将其克隆至pMD18-T载体上,经酶切分析及测序鉴定后,进一步亚克隆至原核表达载体pGEX-KG中,转化大肠杆菌BL21中诱导表达。蛋白纯化后,免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,经1：100倍稀释后用于Westernblot分析。结果表明：克隆得到了鸭MHCⅡβ链基因,大小为798bp,经核苷酸测序与已登录的基因序列同源性为92％;成功构建了原核表达载体,融合蛋白得到了高效表达且纯化后纯度达95％。制备的鼠抗鸭MHCⅡβ多克隆抗体,经酶联免疫吸附实验（ELISA）与免疫印迹法（Westernblot）证实抗体的效价高、特异性强,为深入研究鸭MHCⅡ奠定了基础。     

新疆褐牛CD46基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

旨在克隆并表达新疆褐牛CD46基因,制备其多克隆抗体,为进一步研究牛CD46分子生物学功能奠定基础。采用RT-PCR方法从新疆褐牛脾脏中扩增CD46基因全长,进行测序,并对测序结果进行生物信息学分析,将CD46部分序列亚克隆于pET-28a(+)和pVAX1载体中。将阳性重组质粒pET-28a-△CD46转化于E.coli Rosetta-gamiB(DE3)感受态细胞,诱导表达截短CD46蛋白。用切胶纯化的His-△CD46融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;采用ELISA测定多克隆抗体的效价;取无内毒素重组质粒pVAX1-△CD46转入BHK-21(仓鼠肾细胞)细胞,表达产物以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测该多克隆抗体的特异性。CD46基因的测序结果表明,部分基因蛋白表达、纯化条带大小与预期一致;制备的抗牛CD46多克隆抗体效价高于1∶128 000,并具有良好的特异性。     

山羊β雌激素受体多克隆抗体的制备及免疫组化方法的建立

本研究旨在克隆济宁青山羊雌激素受体β(ERβ)基因,进行原核表达,制备多克隆抗体,建立免疫组化分析方法,检测济宁青山羊卵巢和子宫内ERβ分布。根据GenBank发布的绵羊ERβ基因序列设计一对引物,应用RT-PCR方法从济宁青山羊卵巢组织中扩增ERβ部分基因。经双酶切和测序分析后,连接到原核表达载体pET32a(+),构建重组表达载体pET32a(+)-ERβ,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定;经Ni-NTA纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并检测抗体效价及特异性;使用该抗体检测济宁青山羊卵巢和子宫组织细胞中的ERβ分布。结果表明,成功扩增出ERβ部分基因,并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌中表达出相对分子质量约为53ku的融合蛋白;Western blotting证明该融合蛋白能与兔抗人的ERβ多克隆抗体特异性反应。制备的多克隆抗体经ELISA检测效价达到1∶213,以此抗体代替购置的标准兔抗人ERβ抗体,进行Western blotting反应,特异性良好;使用该抗体建立免疫组化方法检测结果表明济宁青山羊卵巢颗粒细胞和子宫内膜上皮细胞、平滑肌细胞存在ERβ的分布。本研究获得特异性兔抗山羊ERβ多克隆抗体,使用该抗体建立免疫组化方法首次报道了济宁青山羊卵巢和子宫ERβ的分布表达,为进一步研究β雌激素受体的生物学功能奠定了方法学和形态学基础。     

抗家禽Beta-连环蛋白多克隆抗体的制备及鉴定

本研究旨在制备能结合家禽Beta-连环蛋白(β-catenin)的特异性多克隆抗体并进行生物学鉴定。根据GenBank中公布的β-catenin序列,经生物软件比对分析筛选一段抗原性好的序列合成多肽,将多肽与KLH偶联免疫新西兰兔。免疫血清经多肽亲和层析后制得纯化的多克隆抗体,并利用Western blot、间接免疫荧光、免疫组化方法对多克隆抗体进行生物学鉴定。研究表明制备的抗家禽β-catenin多克隆抗体可有效检测家禽细胞中天然的β-catenin蛋白。     

磺胺甲噁唑抗原合成及其抗体的制备

采用重氮化法将磺胺甲噁唑(SMZ)与人血清白蛋白偶联形成免疫原,免疫大白兔制备多克隆抗体。通过紫外扫描和高效液相色谱分析偶联物,免疫抗原的偶联率为19∶1,改良辛酸-饱和硫酸铵纯化抗体,多克隆抗体效价达1∶105,间接酶联免疫吸附试验建立的SMZ检测的线性范围在0.1ng/mL~10μg/mL之间,50%抑制率检测限为22.53ng/mL,抗体与磺胺甲噁唑交叉反应率为100%,与其他7种磺胺药交叉反应率很低。表明制备的磺胺甲噁唑多克隆抗体具有很高的特异性,可用于SMZ在动物性产品中残留的检测。     

氨苯磺胺多克隆抗体的制备

采用重氮化法将氨苯磺胺与人血清白蛋白偶联形成免疫原，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。通过紫外扫描分析，免疫原中药物分子与蛋白质分子的偶联比为32：1，改良辛酸-饱和硫酸铵法纯化抗体，多克隆抗体效价达1：10^5，间接ELISA建立的氨苯磺胺检测的线性范围为1ng／mL～100μ/mL，70％抑制率可检测最低浓度为0．09μ/mL，以抗体与氨苯磺胺的反应率为100％，抗体与其他7种磺胺药交叉反应率很低。结果表明，制备的氨苯磺胺多克隆抗体具有很高的特异性，可用于动物性食品中氨苯磺胺残留的检测。     

山羊乳酪蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

制备山羊乳酪蛋白单克隆抗体可以为检测乳品中山羊乳成分提供免疫学检测手段。以山羊酪蛋白免疫Balb/c小鼠,应用细胞融合技术,制备特异性识别山羊乳酪蛋白的单克隆抗体,对获得的阳性杂交瘤细胞进行连续传代和反复冻存以测定其稳定性,并对其分泌的单克隆抗体应用ELISA进行抗体特异性分析,对特异性识别山羊乳酪蛋白的单克隆抗体进行抗体亚型鉴定和染色体组型分析。最终,成功的筛选出可以分泌特异性识别山羊乳酪蛋白的单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,被命名为7H。经染色体组型分析,染色体数目为102条;单克隆抗体7H类别为IGg1,轻链为κ;经连续传代和反复冻存,ELISA检测细胞上清抗体发现其OD450nm值无显著性差异。     

牛抵抗素多克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

用纯化的可溶性重组牛抵抗素蛋白免疫健康家兔,制备了多克隆抗体,并对多克隆抗体进行了纯化、效价测定、特异性检测,初步建立了检测牛抵抗素的间接ELISA方法。     

四环素多克隆抗体的制备、鉴定及ELISA检测

采用戊二醛交联法和混合酸酐法制备了四环素-BSA完全抗原,分别将两种不同偶联法制备的四环素-BSA完全抗原按照常规免疫程序免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,酶联免疫吸附法鉴定出多抗中含有四环素的特异性抗体,特异性抗体效价最高达1:320000,抑制率为50%(IC50)时的四环素浓度为92.6μg/mL,四环素的最低检测限为6.25μg/mL,四环素和金霉素的交叉反应率达到78%,该方法灵敏度高,为试纸条法快速检测四环素类的残留奠定了基础。     

绵羊肌肉抑制素C-端的表达、纯化及多克隆抗体的制备

为深入了解绵羊myostatin基因的表达及调控机理,进行了绵羊myostatin蛋白多克隆抗体的制备.首先将绵羊myostatin基因C-端克隆人含组氨酸标签的表达载体pET-30a-c(+)中,转化大肠杆菌BL21后IPTG诱导表达,然后利用Ni2+亲和层析纯化重组蛋白,薄层扫描及Bradford法分别检测纯化后蛋白的纯度与含量.应用重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,利用间接ELISA法检测多克隆抗体效价,用Western blot及免疫细胞化学染色检测抗体特异性.结果,薄层扫描分析纯化后蛋白纯度可达95%以上,Bradford法检测蛋白浓度约5 mg·mL-1,制备的抗血清效价可达1:250 000以上,Western blot检测证明抗体特异性良好,免疫细胞化学染色表明抗血清可检测剑肌肉细胞中内源性myostatin的表达,说明所制备的多克隆抗体可以应用于进一步研究,有助于阐明绵羊myostatin的表达及调控机理.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的表达及多克隆抗体制备

为高效表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白并制备多克隆抗体,参考牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因组序列设计一对引物,利用RT-PCR扩增出822 bp的E2基因片段,经测序鉴定正确后,将其定向克隆至原核表达载体pET32a(+)中,鉴定正确后,在大肠埃希菌BL21(DE3)细胞内得到了以包涵体表达形式存在的重组融合蛋白,重组蛋白亲和层析纯化后,免疫印迹鉴定表明重组蛋白能够被牛病毒性腹泻病毒阳性血清特异性识别,具有良好的反应活性.将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测定其抗体效价达1∶25 600.本研究所表达的E2蛋白及制备的多克隆抗体,为E2蛋白结构、功能的研究以及抗原表位的鉴定奠定了基础,为进一步开发牛病毒性腹泻病毒快速检测试剂提供了条件.     

基于N蛋白的牛冠状病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)抗体间接ELISA检测方法,对BCoV的N基因进行克隆,利用原核表达制备重组N蛋白,以纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立ELISA检测方法,并对随机收集的奶牛血清样本进行检测.结果显示,重组N蛋白大小为50 ku,经Western blot鉴定重组N蛋白...     

鸡MHCⅠα和β2m的原核表达与多克隆抗体的制备

为制备MHCⅠ基因工程疫苗的基础材料,构建了鸡MHCⅠ分子重组质粒并进行原核表达,进而制备鸡MHCⅠ分子的多克隆抗体。应用PCR方法,克隆鸡MHCⅠα和β2m基因,构建重组载体pETMHCⅠα和pET-MHCⅠβ2m,经PCR、双酶切和测序鉴定后,将重组质粒在大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达,融合蛋白纯化后,接种昆明小鼠制备多克隆抗体,血清稀释后用免疫印迹法(Western blot)分析。结果表明,鸡MHCⅠα和β2m基因在大肠埃希菌中成功表达,融合蛋白分子质量分别约为52.1ku和33.0ku;制备的鼠抗鸡MHCⅠα和β2m链多克隆抗体,经Western blot检测证实抗体特异性较强,可进一步用于鸡MHCⅠ分子的研究。