马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

将马立克氏病病毒gB基因用EcoR I从质粒pUR-MDVEgB中切下。两端补平后，插入到质粒pEFgpt12s的Pst I酶切位点。构建了含有完整的MDVgB基因的转移载体pEFgpt12s-gB。这个载体的特点是，它含有两个启动子，在强的复合启动子Spromoter的下游是插入的gB基因，另一个反向启动子vvP7.5的下游 是标记基因Ecogpt，它的两端是FPV的非必需区。携带gB基因的质粒pEFgpt12s-gB通过磷酸钙的方法转染用282e4株FPV感染3-4h的鸡胚成纤维细胞。通过药物筛选 ，得到含有gB基因的重组病毒。通过PCR、免疫荧光检测，证实了重组病毒中含有gB基因，并且gB糖蛋白也得到了表达。     

鸡马立克氏病基因工程二价苗重组病毒分子生物学特性鉴定

用磷酸钙沉淀法将MD Ⅰ型病毒gB基因插入到HVT病毒载体中制成MD重组病毒DNA，再将重组DNA转染于鸡胚成纤维细胞上，形成的病毒蚀斑与HVT病毒蚀斑形态相似，经复制2～3代后，提纯病毒DNA，PCR扩增后电泳分析，凝胶上形成一条2．9kb左右的条带。将重组病毒负染后电镜观察，病毒粒子形态与HVT病毒相似，再将重组病毒的DNA进行测序，结果表明，gB基因已经重组在二价病毒中，并能够稳定遗传。     

miRNA干扰gM基因对马立克氏病病毒体外复制的抑制作用

用miRNA Target Finder分析软件预测干扰RB1B株马立克氏病病毒（Marek’s Disease Virus，MDV）gM基因翻译的潜在靶序列，从中筛选出3个作为干扰对象，根据干扰载体pRFPRNAiC特点，设计合成3对单链DNA序列，经PCR反应扩增出双链DNA，并将其插入干扰载体pRFPRNAiC，构建重组干扰质粒pRFPRNAiCgM1、pRFPRNAiCgM2、pRFPRNAiCgM3。将质粒pRFPRNAiCgM1以不同的剂量转染鸡胚成纤维（CEF）细胞，确定最佳转染质粒量，试验结果表明1μg转染剂量转染效果最佳。以1μg剂量将3种重组干扰质粒分别转染CEF细胞，24h后感染RB1B株MDV，72h后用空斑计数MDV在CEF细胞上增殖数量，以此判定miRNA干扰效果，结果显示，重组干扰质粒中质粒pRFPRNAiCgM2干扰效果较好，能有效抑制MDV在CEF上的生长繁殖。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组马立克氏病病毒的构建

采用聚合酶链反应或反转录聚合酶链反应扩增出H5亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因、网状内皮增生症病毒的长末端重复序列(LTR)、马立克氏病病毒(MDV)Rispens CVI988毒株基因组的sorf 1和sorf 2序列、两端带loxp位点的lac/smGFP标志基因,构建含这些基因的转移载体质粒pMHA;以MDV Rispens CVI988毒株的基因组DNA和PMHA质粒DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),采用同源重组方法将LTR、lac/smGFP和HA基因插入到MDV基因组,获得重组病毒rMDV-HA/GFP;以cre介导的同源重组去除lac/smGFP标志基因,再转染CEF,获得仅带LTR启动子和HA基因的重组MDV疫苗毒株rMDV-HA.rMDV-HA仍保留了MDV RispensCVI988疫苗毒株的复制特点,并能稳定表达AIV的HA.     

表达MDV—gB基因的重组鸡痘病毒免疫效果观察

将马立克氏病病毒（MDV）gB基因插入鸡痘病毒中，构建了含有MDV－gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV)，用rFPV、火鸡疱疹病毒（HVT）冻干疫苗、rFPV HVT二联疫苗分别免疫1日龄AA肉用雏鸡，8日龄攻毒后观察免疫保护效果。结果表明，3种疫苗均诱导了免疫应答，免疫保护率分别为69％、69％和85％。该重组病毒疫苗的免疫效果与HVT疫苗的免疫效果相当，二者联用具有免疫协同作用。     

禽马立克氏病毒糖蛋白B基因在家蚕中的表达

将马克克氏病毒（Marek'sdiseasevirus，MDV）糖蛋白B（gB）基因克隆入转移载体pBac－PAK8中，得到重组转移载体质粒pBacPAK（gB）。经限制性酶切图谱结合Southernblot分析鉴定表明，gB基因以正确方向插入转移载体，受多角体蛋白基因启动子控制。将此转移载体与经CvnI酶切线性化的亲本病毒Bm－BacPAK6DNA通过脂质体法共转梁家蚕细胞，只有发生重组的病毒才有复制增殖的能力。然后通过蓝白斑筛选、结合点杂交，纯化得到重组的空斑病毒vBM，用该重组病毒接种家蚕5龄幼虫，对表达产物进行SDS－PAGE分析，检测到gB基因在家蚕中高效表达，表达产物的分子量主要为97KD，表达量约为1mg／mL血淋巴。     

地高辛标记探针检测重组鸡痘病毒中的MDVgB基因

以XbaI从pVLgB中切下gB基因片段，用dig试剂盒通过六聚核苷酸随机引物合成DNA探针，对粗提的重组FPV、MDVGA、FPV282E4和CEFDNA以及pFGB1175质粒DNA进行打点杂交（Dot－blot）。经免疫学测定、NBT显色后发现，重组FPV、MDVGA、pFGB1175斑点呈明显阳性反应；而FPV282E4和CEFDNA则呈阴性反应．从而在DNA水平上证实了重组FPV基因组中gB基因的存在。     

马立克氏病病毒CV1988株pp24基因的克隆与表达

根据马立克氏病病毒（MDV）国际参考强毒CA株pp24基因序列，设计和合成了一对引物，其两端分别含SalI和EcoRI的酶切位点，以CV1988株基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增其pp24基因。PCR产物经纯化后，按正确的阅读框架定向克隆到表达性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游，并用序列测定验证。将重组质粒转化的大肠杆菌BL21，在1.0mMIPTG和37℃条件下诱导，GST-pp24基因获得了表达。诱导菌体的裂解物经12%的SDS聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）和Westemblot试验验证。得到大小为43kD的融合蛋白，与预期大小一致。将该融合蛋白的凝胶带切下研碎后免疫小鼠三次后，其血清与MDV感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在间接免疫荧光试验中呈阳性反应。     

表达马立克氏病病毒CVI988／Rispens株糖蛋白B基因的重组鸡痘病毒疫苗的免疫保护研究

用鸡痘病毒载体表达马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白B（gB）基因构建成重组鸡痘病毒（rFPV）。以MDV　GA或Md5和RBIB混合攻毒，在不同品种的鸡中评价rFPV－gB／R单价苗和与火鸡疱疹病毒（HVT）组成的二价苗的免疫保护效力。试验结果表明，MDV疫苗和FPV母源抗体阴性的SPF鸡和母源抗体阳性的商品鸡中，rFDV－gB／R均能提供免疫保护作用，且其中一种商品蛋鸡中rFPV－gB／R与HVT液氮苗或HVT冻干苗结合使用，均有显著的免疫协同保护作用。免疫学研究指出，rFPV－gB／R与常规疫苗一样，可显著地降低疫苗免疫攻毒鸡的病毒血症和羽囊排毒。     

表达鸡马立克氏病病毒gB基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性及生物安全性评价

为了评价表达鸡马立克氏病病毒gB基因重组鸡痘病毒(rFPV-gB/R)的遗传稳定性,我们将纯化后的重组病毒在CEF单层上连续传30代,引起细胞病变的速度和形态均未发生明显变化;覆盖含X-Gal的琼脂引起的空斑均为蓝色;间接免疫荧光实验证明rFPV-gB/R中的gB基因始终能稳定表达;序列测定结果表明,重组病毒在细胞上连续传30代、在SPF鸡上连续传5代后,gB基因序列没有发生任何变化;以0、10、20、30代重组病毒制成冻干疫苗进行的实验室免疫效力实验表明,细胞连续传代后rFPV-gB/R仍然保持了原有的免疫原性。可见重组鸡痘病毒gB基因的结构和免疫原性都是高度稳定的。为了评价rFPV-gB/R的生物安全性,我们将rFPV-gB/R通过SPF鸡连续传5代,检测病毒在鸡体的存在部位及其消长、生长繁殖性能和毒力变化;将rFPV-gB/R免疫鸡与未免疫鸡同笼饲养,攻击FPV-102E6强毒,以检测rFPV-gB/R感染鸡的接触传染性。结果显示,rFPV-gB/R在鸡体的存在时间大约为7d,在体内仅存在于接种部位;鸡体传代后痘病毒毒力有一定程度下降,gB基因核苷酸序列未发生任何变化;同居未免疫SPF鸡在痘病毒强毒攻击后全部发痘,可见重组病毒免疫鸡没有接触传染性,能在鸡体内稳定地传代,rFPV-gB/R具有高度的生物安全性。     

利用BrdU在CEF（TK^＋）细胞中筛选TK^—重组鸡痘病毒

将新城疫病毒（NDV）四平株HN基因，插入不含报告基因，以TK为侧翼的鸡痘病毒表达载体pUTA-2中的复合启动子下游，获得重组表达质粒pUTA-2HN。将重组表达质粒转染鸡痘病毒（FPV）感染的鸡胚成纤维细胞（CEF），培养、收获病毒后，用含40mg/L5－溴－2－脱氧尿嘧啶（BrdU)的培养液，在CEF（TK^ )细胞中筛选培养2代，然后用不含BrdU的培养液进行病毒蚀斑纯,化成功筛选出表达NDV HN蛋白的TK^-重组鸡痘病毒。     

表达马立克氏病病毒CV1988／Rispens株糖蛋白B基因的重组鸡痘病毒疫苗的免疫保护研究

用鸡痘病毒载体表达马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白B（gB)基因构建成重组鸡痘病毒（rF-PV)。以MDV GA或Md5和RBIB混合攻毒，在不同品种的鸡中评价rFPV-gB/R单价苗和与火鸡疱疹病毒（HVT）组成的二价苗的免疫保护效力。试验结果表明，MDV疫苗和FPV母源抗体阴性的SPF鸡和母源抗体阳性的商品鸡中，rFDV-gB/R均能提供免疫保护作用，且其中一种商品蛋鸡中rFPV-gB/R与HVT液氮苗或HVT冻干苗结合使用，均有显著的免疫协同保护作用。免疫学研究指出，rFPV-gB/R与常规疫苗一样，可显著地降低疫苗免疫攻毒鸡的病毒血症和羽囊排毒。     

马立克氏病病毒类白细胞介素8(vIL-8)基因的克隆和表达

用马立克氏病痛毒(MDV)感染鸡胚成纤维细(CEF)，提取总RNA，经RT—PCR扩增出由MDV编码的病毒类白细胞介素-8(vIL-8)基因，并将其克隆进pGEM—Teasy载体中，测序进行分析。将vIL-8基因片段插入表达性载体pGEX-5x-3中，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导。结果获得了重组vIL-8-GST融合蛋白的表达。表达产物活性分析表明，vIL-8基因重组产物具有趋化鸡外周血淋巴细胞的活性。提示，MDV在致瘤过程中，vIL-8能吸引易感细胞促进病毒感染，并可能参与肿瘤的扩散和发展。     

马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白D基因的分离克隆,定序及其在大肠杆…

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白（ｇＤ）抗原基因１２０９ｂｐ编码序列。将该ＰＣＲ扩增产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎⅠ位点克隆进行ｐＵＣ１８质粒载体中。将ｇＤ重组ｐＵＣ１８质粒ＤＮＡ用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记后，在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中，该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的Ｂａｍ ＨＩ－Ａ克隆中的Ａ     

表达鸡新城疫病毒F蛋白的重组马立克氏病毒的构建及其鉴定

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的重组马立克氏病毒(MDV),本研究采用RT-PCR方法从NDV强毒株F48E9基因组中扩增出病毒的融合蛋白F基因,构建由CMV启动子和BGH polyA组成的2.7 kb F基因表达盒。将其插入带有黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)和MDV US2同源臂的中间转移载体pUAB-gpt中获得重组MDV转移载体pUAB-gpt-wF。将该转移载体与MDV-814疫苗株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)总DNA共转染CEF,经同源重组及gpt选择系统筛选,获得带有F基因表达盒的重组MDV(rMDV814-wF)。其体外增殖与亲本病毒没有差异。经间接免疫荧光试验、PCR、Southern-blot及western blot等试验证明,重组病毒在CEF中传至13代以上仍稳定表达NDV的F蛋白。该重组病毒的构建为MDV活载体疫苗的筛选及应用奠定了基础。     

表达鸡马立克氏病病毒糖蛋白B基因重组鸡痘病毒毒种的纯净性检验及中试冻干疫苗的保存期测定

为了检测高效表达鸡马立克氏病病毒gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV-gB/R）的纯净性,对纯化后的0代重组病毒毒种进行了细菌和支原体检验;并对中间试制的冻干疫苗在-20℃保存期进行了测定。结果表明,重组病毒毒种高度纯净,没有污染任何细菌或支原体,符合新制品制造和检验规程申报的要求;中试冻干疫苗在-20℃保存了12个月,病毒含量始终大于109PFU/mL,疫苗保存期可达12个月。     

马立克氏病病毒meq基因缺失株细菌人工染色体序列自我敲除的分子鉴定

本试验旨在对缺失meq基因的马立克氏病病毒(MDV)感染性克隆基因组中细菌人工染色体(BAC)序列的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9-1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞(CEF)拯救SC9-1重组病毒。将SC9-1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养,利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列。分别提取1~10代不同代次SC9-1重组病毒的DNA作为模板,利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测。利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物,以MDV保守基因pp38作为内参,对不同代次病毒基因组中BAC序列进行荧光定量PCR的检测。利用PCR扩增SC9-1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列,通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除。利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示,1~5代病毒DNA均能扩增出600 bp的特异性目的条带,证实病毒的基因组中含有BAC序列。6~10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带,证实病毒基因组中没有BAC序列。荧光定量PCR结果显示,病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少,直至第6代已经完全检测不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的过程中,对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定,结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点,序列同源性均在99.7%以上。结果表明,利用cre/loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将MDV meq基因缺失株SC9-1的BAC序列完全敲除掉,且同源重组酶敲除BAC序列具有高度一致性。     

DNA免疫防制鸡马立克氏病的初步研究

将MDVgB基因插入真核表达质粒pcDNA3 CMV启动子下游多克隆位点,构建成重组真核表达质粒pcDNA3-gB。将重组真核表达质粒分2组进行雏鸡腿部肌肉注射。雏鸡进行一免,2周后一组用重组真核表达质粒再加强免疫一次,另一组用构建的重组鸡痘病毒（rFPV）加强免疫。2周之后攻毒,观察免疫保护效果。2次用重组真核表达质粒免疫组的免疫保护率为75％;而先免疫重组表达质粒,后免疫rFPV组的免疫保护率仅为50％。结果表明,MDVgB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,但rFPV不能对其加强免疫。     

马立克氏病病毒糖蛋白B基因克隆及其在家蚕细胞中的表达

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株基因文库中的ＢａｍＨＩＩ３和Ｋ３克隆质粒分别用双酶切消化，获得２．８ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＳａｌⅠ片段和１．１ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ片段，然后将这２个片段定向克隆于载体ｐＵＲ２２２中，构建了含ＭＤＶ糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组质粒。为了基因操作方便和高效表达，设计了１对带有酶切位点的引物，用ＰＣＲ扩增了ＭＤＶｇＢ基因部分片段，并按正确方向插入去磷酸化的载体质粒中，得到起始密码子前带有ＥｃｏＲＩ酶切位点的ＭＤＶｇＢ基因克隆，再将该基因插入去磷酸化的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）转移载体ｐＢＦ１４中，ＤＮＡ序列分析确证了克隆基因及阅读柜架的正确性。以重组转移载体与野生型ＢｍＮＰＶ共转染家蚕细胞，用有限稀释法点杂交结合空斑技术纯化重组病毒。用荧光抗体试验检查重组病毒感染的家蚕细胞，可见感染细胞的胞浆及胞膜出现强荧光反应     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核表达产物单抗的制备

用大肠杆菌BL21表达了马立克氏病病毒（MDV）强毒GA株的囊膜糖蛋白B（gB)基因，通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶龟泳（SDS－PAGE）分离表达蛋白条带，切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光试验（IFA），得到1株GA株阳性的单克隆抗体杂交瘤细胞株7C8。该单抗腹水的ELISA效价为1：2^12，IFA效价为1：800，与MDV不同致病型毒株CVI988、GA、RB1B、MD11、648A株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）均呈IFA阳性。1：100稀释时与GA感染的CEF在斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA)中呈阳性。