外源转入基因在小麦中的遗传规律及其对农艺性状的影响

利用农杆菌介导法将外源基因GUS和nptⅡ导入了3个小麦基因型新春9号、Bobwhite和PM97034，经对自交后代连续3代进行PCR、组织化学染色及ELISA检测和筛选，获得了纯合稳定转基因株系。以3个受体亲本为对照，随机区组、重复3次设计，对纯合稳定转基因株系进行了株高、穗长、穗粒数、穗粒重、千粒重、成熟期等农艺性状调查，研究外源转入基因对主要农艺性状的影响。结果表明，转基因株系除株高和生育期与对照有显著差异外，其他农艺性状差异均未达到显著水平。进一步以新春9号转基因株系与新春9号（CK）杂交，对F₁代和F₂代植株进行PCR、组织化学染色和ELISA检测，分析外源转入基因在小麦遗传背景中的遗传规律。结果表明，GUS基因和nptⅡ基因在F₁代中表现完全显性，在F₂代中呈现2.6︰1的分离比例，符合孟德尔遗传规律。     

转基因抗虫水稻后代农艺性状变异的比较研究

采用群体分离法（Bulk sergeant analysis,BSA）和比较分析方法,以转基因水稻高代材料与非转基因水稻杂交得到的3个F2群体和1个DH群体为材料,分析遗传背景与外源基因对转基因水稻后代农艺性状变异的影响。结果发现,父本的遗传背景对农艺性状表现存在一定的影响;在消除环境因素影响的条件下,F2群体中外源基因对农艺性状变异起到重要作用,并促使农艺性状的分离程度增加。而DH群体中尽管外源基因促进株系变异系数增加,但对主要农艺性状变异的作用不显著。说明组织培养是产生农艺性状变异的主要原因,而外源基因的导入增加了农艺性状变异发生的机会。     

转epsps-G6基因棉花的Southern杂交及遗传特性分析

为鉴定epsps-G6基因成功导入棉花基因组并分析转基因抗草甘膦棉花的拷贝数和遗传特性,以花粉管通道法获得的8个转epsps-G6基因抗草甘膦棉花株系(G6-1、G6-4、G6-5、G6-7、G6-11、G6-19、G6-20、G6-25)为材料,通过Southern点杂交、双酶切和单酶切的Southern杂交后进行分析,结果表明,外源epsps-G6基因已成功整合到棉花基因组上,且其中4个转化株系含有单拷贝插入的epsps-G6基因。选用其中3个单拷贝插入、自交纯合且草甘膦抗性强的株系G6-1、G6-5、G6-19,分别与转基因遗传背景材料(中棉所49)和陆地棉标准系(TM-1)进行正反交,遗传分析结果表明,这3个转基因株系均符合3∶1的孟德尔分离规律,不受细胞质效应的影响。     

转EPSPS基因抗草甘膦棉花的遗传分析

为分析转基因抗草甘膦棉花早代遗传情况,以花粉管通道法获得的26个转5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSPS)抗草甘膦棉花转化事件为材料,以其背景亲本中棉所49为对照,喷施草甘膦后对转基因棉T1、T2分离比例进行考察。T1田间抗性鉴定结果表明,经卡方检测20个转化事件T1分离符合3∶1的分离规律,即外源基因插入1个位点;6个转化事件不符合1对基因的分离规律,出现了偏分离。T2田间抗性鉴定结果表明,通过花粉通管法共获得152个纯合株系,分别来源于25个转化事件;对T2不纯合株系继续进行分离比例的考察,发现来源于15个转化事件的57个株系符合3∶1的分离规律;此外卡方检测结果表明,每个转化事件都有不符合3∶1分离规律的株系,且其中10个转化事件没有符合3∶1分离规律的株系。表明通过花粉管通道法获得的转基因植株中外源基因的整合和遗传均较复杂。     

转基因小麦外源品质基因1Dx5表达的遗传研究

转基因小麦B72-8-11b中外源品质基因1Dx5表达量是内源相应基因表达量的6倍。利用小麦转基因品系为父本，常规品种鄂麦12、鄂麦18和日喀则8号分别为母本，配置3个杂交组合。采用SDS—PAGE技术，检测各组合亲本、F1、F2代的HMW-GS组成，研究转基因小麦B72-8-11b中外源品质基因1Dx5表达的遗传。结果表明：外源1Dx5基因有功能拷贝整合在1个位点，如同内源品质基因，遵从孟德尔遗传模式。这对育种选择策略的制订具有指导意义，也表明了基因枪转化法能够使得外源基因有功能拷贝整合在1个位点并能稳定传递。     

转基因水稻中外源sck基因的遗传表达特性

利用转sck基因高代稳定水稻亲本和组合为材料,研究了外源sck基因的遗传表达特性.结果表明:外源sck和hpt基因都能自交连锁稳定遗传到T11并表达,且连锁基因和表达活性可杂交转移到不育系和杂交组合中,外源sck基因在杂种F2代以单基因显性遗传3∶1的模式进行分离,但也出现自交hpt基因丢失,杂交hpt基因甚至sck基因未获得成功转移的现象.田间抗虫性观测表明,转sck基因水稻对钻蛀性螟虫抗性不足,对卷叶螟具有一定抑制作用.外源sck基因在转化或杂交转育的亲本及组合中均获得表达,且具有一定的空间分布特性和基因累加效应,基本为叶片的表达活性高于叶鞘.     

转基因水稻高世代农艺性状的表现

以转SCK基因和bar基因粳稻恢复系超优1号和转GNA基因和hyg基因粳稻保持系早花二号自交高代(恢复系T5,T6,保持系T4,T5)材料为试材,进行抗性筛选鉴定和农艺性状考察。结果表明:转基因恢复系表现高抗除草剂,对二化螟呈不同程度抗性;保持系表现高抗潮霉素,大部分株系低抗稻飞虱,个别高抗褐飞虱、白背飞虱,田间表现高抗条纹叶枯病;转基因不育系表现高抗潮霉素;外源基因导入粳稻恢复系和保持系并在高代稳定表达。转基因恢复系生育期、株高、穗长、穗颈节等性状有不同程度变异;保持系株高、穗型变异较大。转基因恢复系与转基因不育系配制的多元转基因杂交组合F1表现高抗除草剂和潮霉素,其他农艺性状表现与对照(非转基因组合)基本一致。对转基因水稻的安全释放进行了探讨。     

农杆菌敏感小麦基因型的筛选及其转化

利用C58c1农杆菌菌株（其携带的pPTN290质粒载体上含有nptⅡ 基因和GUS基因）为供体材料和小麦幼胚为受体材料,对我国35个春小麦基因型进行了农杆菌敏感性研究和转化研究。组织化学染色结果表明,PM97034、P187、巴140105、扬麦158、新春9号和克丰6号等基因型农杆菌感染后GUS基因瞬时表达率达到了15.0% ~ 30.0%,显著高于模式基因型Bobwhite。其余幼胚分别在含10-25mg/L G418培养基上诱导愈伤组织和分化植株,抗性再生植株经ELISA检测、PCR检测、叶片离体退绿检测、X-Gluc染色检测和Southerm blot检测,最终从新春9号和PM97034的农秆菌转化效率高于Bobwhite. Southerm blot检测结果同时表明,外源基因在多数转基因植株中表现为单拷贝整合。T₁代植株ELISA检测结果和PCR检测结果表明,外源基因在个别株系中的分离符合孟德尔遗传规律,而在多数株系中的分离偏离了孟德尔遗传规律。阳性植株与阴性植株分离比经X²。适合性检测,表明外源基因在多数株系中的遗传符合3：1分离规律。本文首次对不同小麦基因型进行了农秆菌敏感和转化效率研究,筛选到新春9号和PM97034两个对农杆菌比较敏感且转化效率比较高的基因型,可望广泛用于小麦转基因研究。     

转抗稻瘟病基因水稻遗传和表达的初步研究

稻瘟病是水稻三大病害之一,长期的生产实践证明,水稻抗瘟性品种的选育和利用是防治稻瘟病行之有效的措施。溶菌酶是一个广泛分布的酶家族,并且具有几丁质酶的活力,能够分解细菌或真菌细胞壁组分中多糖的糖苷键,从而抵御病原菌的侵染。本文以转溶菌酶基因水稻的10个株系当代及其后代为研究对象,对其农艺性状以及它们对稻瘟病的抗性水平变化进行研究,并利用PCR检测来研究外源基因在转基因株系各世代中的分离规律。结果表明:在R0、R1代群体中农艺性状、外源基因分离情况比较大,在R2代群体中只有个别株系分离较大。在R0代群体中单株之间的表现差异可能是由外源基因插入的位点和拷贝数不同而造成的,R1代表现出来的群体差异要比当代更大,在R1代中的差异可能是由于当代植株中的外源基因是杂合型,分离世代造成的,在R2代群体中由于外源基因趋于纯合,群体中株系相差小,同对照水平接近。与未转化株系比较,转基因植株进行了苗瘟、叶瘟和穗茎瘟的鉴定,在转基因的两个品系中溶菌酶基因的插入整合提高了转基因株系的抗稻瘟病的能力。     

大豆广谱抗源对SMV优势株系的抗性遗传和等位性分析

为了研究大豆广谱抗源对我国大豆花叶病毒优势株系SC3和SC7的遗传方式及抗源材料对SMV抗性基因间的等位性关系,利用广谱抗源科丰1号和齐黄1号与感病材料南农1138-2配制抗感及抗抗杂交组合,通过人工摩擦接种法进行鉴定。结果发现,接种株系SC3和SC7后,科丰1号和齐黄1号与南农1138-2配制抗感组合的F1均表现抗病,经卡方测验,F2抗感分离比例符合3∶1,F2∶3家系分离比例为1(抗)∶2(分离)∶1(感),说明这2个广谱抗源均有1对显性基因控制株系SC3和SC7的抗性;等位性测验结果表明2个抗抗组合的F1对SC3和SC7优势株系均表现抗病,F2分离比符合15(抗)∶1(感),说明科丰1号和齐黄1号对株系SC3和SC7的抗性基因不等位且独立遗传。进一步分析2个广谱抗源携带的抗性基因可以发现,科丰1号对株系SC3的抗性基因RSC3和齐黄1号对SC7株系的抗性基因RSC7Q可能位于大豆的2号和13号染色体上,为利用大豆广谱抗源进行抗SMV育种奠定了很好的基础。     

海岛棉5个CBF/DREB基因的克隆与表达分析

低温、干旱和盐渍是影响作物生长、产量和全球地理分布的重要非生物胁迫。CBF/DREB转录因子是参与植物非生物胁迫应答反应的重要调控蛋白。为了更好地了解棉花CBF家族基因,通过生物信息学的方法,从海岛棉中克隆了5个具有完整开放阅读框的CBF基因,命名为Gb CBF1―Gb CBF5。这5个基因编码的蛋白与其他植物冷胁迫相关的CBF蛋白具有高度的保守性,含有1个AP2功能结构域和2个特征基序。系统进化树分析表明,这5个基因与拟南芥的3个参与冷胁迫的CBF基因一起聚类在DREB亚家族中的A-1亚组。通过RT-PCR的方法分析了海岛棉基因Gb CBF1―5在高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、干旱、4℃低温等非生物胁迫处理下的表达模式。结果表明其中2个基因在冷胁迫下上调表达,5个基因在干旱和盐处理下均下调表达。这些为进一步探索CBF基因在棉花逆境胁迫应激反应中的作用提供了有价值的信息。     

两种拟南芥CBF2基因突变体的鉴定与分析

低温是主要的逆境胁迫之一,限制了作物的地理分布和产量。筛选理想的抗冻靶基因用于分子育种对于稳定农业生产具有重要意义。CBF调节子在植物抗冻反应中扮演主要的角色,CBF2是CBF调节子的组成成分之一,在抗冻反应中扮演负调控的作用。采用qRT-PCR和常规农艺性状测定法对2种CBF2基因突变体cbf2-1和cbf2-2进行了多项指标的鉴定,结果发现在这2种突变体中CBF2基因的表达存在不同程度的缺陷,cbf2-1中CBF2基因受低温诱导表达,但表达量与对照相比,明显下降;而cbf2-2中CBF2基因诱导表达的效应完全丧失。抗冻性检测结果显示CBF2基因的表达量越低,其突变体植株的抗冻性越强,同时冷胁迫后冷响应的下游基因表达量也越高,更重要的是,虽然这2种CBF2基因突变体抗冻性明显增强,但与野生型植株相比,其开花时间和单株种子产量并没有明显变化。以上结果表明CBF2是一种可以利用基因组编辑技术进行作物抗冻育种的理想候选靶基因,可以利用最新的基因组编辑技术进行作物抗冻育种研究。     

甘蓝型油菜细胞核雄性不育系数207AB的选育及遗传

1990年春在低芥酸品系207的株行中发现了两株天然雄性不育株，经3年5代育成了生长发育整齐度好．性状一致，育性分离达到1：1的核不育两用系。遗传研究表明：该不育系是由两对隐性重叠基因控制的一与S45AB、117AB属相同类型，它具有恢复源广，易测配强优势组合的优点。     

转录激活因子CBF与植物的抗胁迫能力

很多低温相关基因的启动子中都含有CRT/DRE元件,CBF蛋白可以与该元件结合而使这些基因得以表达。拟南芥CBF基因有4种,分别为CBF1、CBF2、CBF3和CBF4。CBF1、CBF2和CBF3基因聚集在拟南芥第4染色体的短臂上,CBF4定位在第5染色体上。CBF2与CBF1、CBF3与CBF1的核苷酸序列具有较高的同源性,分别为81%和84%。CBF2和CBF3的氨基酸序列分别与CBF1大约有84%和86%相似,且表达模式完全相同。CBF4蛋白由224个氨基酸组成,与其他CBF蛋白有63%的同源性。在CBF1、CBF2、CBF3和CBF4转基因拟南芥植株中,不需低温刺激,4种CBF基因的组成表达都能够激活含有CRT/DRE元件的COR基因表达,从而提高植株的抗冻性。自1997年发现CBF1基因以来,已有很多成功导入CBF基因的报道。本文就这4个转录因子的性质及其在植物抗寒、抗旱和耐盐方面的作用进行了阐述。     

诱导型和组成型表达的冷诱导转录因子CBF1基因表达载体的构建

为研究冷诱导转录因子CBF1(C-repeat-binding-factor)基因对我国优良豆科牧草--苜蓿的抗寒性的改良作用,试验从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中利用PCR方法分离了CBFI基因及其启动子,分别构建了CaMV 35S启动子和来源于拟南芥的CBFI启动子驱动的农杆菌介导的植物转化表达载体,为下一步研究利用CBF1基因改良苜蓿抗逆性奠定了基础.     

油棕CBF基因的克隆及与禾本科植物CBF基因的进化关系

本研究致力于克隆油棕低温相应转录因子基因CBF。以NCBI网站上公布CBF基因设计引物,对油棕的基因组进行扩增,并对其进行回收,转化和测序。总共测了11个克隆,测序结果显示这11个克隆中有3个不同拷贝的CBF基因序列,它们序列之间的同源性分别是,99%,92%和91%。将克隆的CBF基因与不同物种的CBF基因进行了聚类分析,分析结果显示：这些不同物种的CBF基因可以分为3类,克隆的油棕的3个CBF基因被聚在一块,此外,油棕CBF基因与HvCBF1,OsDREB1E,HvCBF11以及TaCBF11的同源性较高。采用同源序列法,克隆了3个拷贝的CBF基因,通过Blast比对发现,克隆的CBF基因与NCBI数据库现有的CBF基因具有很高的同源性。这些工作将为油棕抗寒的分子选育奠定基础。     

旅大红骨玉米种质掌状扁形果穗的遗传研究

以玉米自交系丹717×丹340组成的6世代群体为材料,利用P1、P2、F1、F2、BC1和BC2 6世代联合分析法,研究旅大红骨种质掌状扁形果穗性状的遗传规律.结果表明:该性状的次数频率分布在F2分离世代呈近似“m”状的双峰分布,B1群体基本表现为直线型分布,B2群体表现为2个峰值的类似正态分布.通过AIC值进行适合性检验,该性状符合2对主基因+加-显-上位性B-1-1模型,2对主基因的加性效应占据主导地位且互作效应明显,加性效应值分别为2.42和1.86,主基因的遗传率介于46.2％～68.8％之间,在自交进代过程有逐渐下降的趋势,育种中应注重早代试材的筛选,或进行回交选育以提高育种值.     

转双价抗虫基因BmkIT-Chitinase玉米株系的获得

通过超声波辅助花粉介导法,将双价抗虫基因BmkIT-Chitinase分别导入以玉米自交系昌7-2及郑58的花粉为受体的不同基因型的自交系中。本研究共处理玉米雌穗1072穗,获得T0代种子1563粒,经卡那霉素初筛,T1代～T4代PCR及SouthernBlot杂交分子跟踪检测共获得20个转化株系,田间抗虫性鉴定表明共有16个转化株系与对照在抗虫性方面有显著差异,且此抗性随着各代稳定遗传。农艺性状调查结果表明,所获得的转基因玉米株系中大部分材料的农艺性状与对照无显著差异,除了N55材料及N20-1材料。N55材料的穗位高度与对照相比略低6±0.5cm,而穗粒数增加75±5粒。而N20-1材料百粒重增加5±0.5g。因此,转入此双价抗虫基因对玉米农艺性状影响不是很大。经过分子检测、田间抗虫性鉴定及农艺性状调查我们最终选育了9个转双价抗虫基因昌7-2自交系优良株系,6个郑58转双价抗虫基因自交系优良株系。