甜菜亚硝酸还原酶基因(NiR)的克隆与表达分析

以甜菜品种甜研7号叶片的cDNA为模板,采用RT-PCR和3′/5′RACE技术,获得了编码亚硝酸还原酶基因(NiR)的cDNA全序列2 014 bp, 包含有1 830 bp的开放阅读框,编码599个氨基酸。所推导的氨基酸序列与菠菜及拟南芥NiR编码的氨基酸序列均具93%的同源性。生物信息学分析表明,甜菜NiR具有完整的NiR蛋白结构,含血红素蛋白β-化合物区域和4Fe-4S区域, 并利用分析软件预测其三维结构。实时荧光定量结果显示,在以0、10、20、30、40、50、80和160 mmol L^–1 NO₃^–-N处理72 h的试验中,50 mmol L^–1处理可使甜菜NiR的表达量达到最大;以0、2、4、8、16、32、64和128 mmol L^–1 NH₄⁺-N处理48 h的试验表明,8 mmol L^–1和64 mmol L^–1处理条件下甜菜NiR表达量相对较高。硝态氮和铵态氮不同配比处理48 h的试验中,NO₃^–-N和NH₄⁺-N比例为80:20可使甜菜NiR的表达量达到最大;在氮素诱导的基础上,蛋白抑制剂放线菌酮处理9 h,随着处理浓度的增大,NiR的表达量逐渐下降;不同浓度NO₂^–处理的试验中,40 mmol L^–1处理下NiR的表达量最大。     

铵态氮和硝态氮配比对烤烟生长及离子平衡的影响

为明确烤烟烟苗阴阳离子平衡对不同铵态氮和硝态氮比例的生理响应,采用水培试验,以云烟87为试验材料,研究了不同铵硝配比处理对烟苗生长和阴阳离子平衡的影响。结果表明,硝态氮比例增加有利于烟苗根、茎、叶生长。苹果酸和草酸含量在全硝处理下显著大于其他处理,而铵硝比25:75处理柠檬酸含量与全硝处理未达到显著差异;阳离子K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺含量随硝态氮比例增加呈增加趋势,而铵硝比50:50处理无机阴离子NO₃^–和SO₄^2–含量最大,分别为0.06和1.03mmol/g,Cl^–含量在铵硝比75:25处理下显著大于其他处理,H₂PO₄^–含量随硝态氮比例增加而增加,随后保持不变,最大值为0.20mmol/g。随硝态氮比例的增加,阴阳离子平衡先呈碱化趋势后呈酸化趋势,全硝处理下阴阳离子平衡结果最差,为3.43mmol/g,但并未造成离子失衡。综合考虑,氮素形态以...     

非生物胁迫诱导的GmMYB的克隆与表达分析

本研究室根据一段抗逆的EST序列, 从栽培大豆东农42中克隆到4个开放阅读框均是外显子和内含子间隔构成的R2R3-MYB基因, 其中Gm02g01300、Gm03g38040和Gm10g01340与已公布的Willams 82基因组序列完全一致, Gm19g40650第375位的单核苷酸突变导致多肽链第125位的氨基酸发生置换(GAG³⁷⁵→GAC³⁷⁵, E¹²⁵→D¹²⁵)。以人工气候箱内模拟非生物胁迫(盐、碱、干旱和低温)处理栽培大豆东农42芽期, 选择适宜时间点, 采用荧光定量PCR技术, 检测R2R3-MYB基因的表达。结果表明, 4个基因的表达水平都存在明显波动, 呈诱导后短暂上调或下调两种表达模式, 但表达时间、强度和趋势存在明显差异; Gm02g01300受干旱诱导明显, Gm03g38040受多种胁迫条件诱导表达强烈, 推测这些基因在大豆非生物胁迫的调控中起到重要作用; 另外, 在子叶与胚间, 单个基因的表达也存在差异; 多种非生物胁迫条件下, 基因的表达不仅存在时空差异, 可能也具有调控模式的差异。     

不同铵硝比的氮素营养对菠菜产量和可溶性草酸含量的影响

【目的】采用水培试验,研究了不同铵硝比的氮素营养对菠菜产量和可溶性草酸含量的影响。【方法】用5种不同铵硝比的氮素营养处理菠菜幼苗,36d后采集样本,观察不同铵硝比的氮素营养对菠菜产量和草酸含量的影响。【结果】（1）从铵硝比100:0到0:100,随着营养液中硝态氮比例的增加,菠菜地上部鲜重不断增加,铵硝比为0:100时,菠菜的产量最高,地上部单株鲜重平均值为6.2g,分别是铵硝比为25:75和100:0处理的1.2倍和5.9倍;（2）随着铵硝比的降低,菠菜茎叶中可溶态草酸的含量是逐渐降低的,在铵硝比为25:75时,菠菜茎叶中草酸含量最低,之后又呈现上升趋势。营养液中硝态氮占全氮的百分数和菠菜茎叶中可溶态草酸含量之间呈现出显著的二次曲线相关。【结论】铵硝比越低,菠菜产量越高;铵硝比为25:75时,菠菜茎叶中草酸含量最低     

氮肥形态配比对烤烟中性致香成分含量及产质量的影响

为明确氮素形态对烟叶品质和经济性状的调控效应,通过田间试验,研究铵态氮和硝态氮配施对烟叶化学成分含量、中性致香成分含量、感官质量及产量的影响。结果表明,铵硝配施显著提高了烟叶还原糖、总糖和钾含量,降低了总植物碱含量。铵硝配施处理的类胡萝卜素类、苯丙氨酸类、棕色化产物类和类西柏烷类致香成分含量低于单施铵态氮处理,与单施硝态氮处理差异较小。新植二烯含量和总中性致香成分含量以单施硝态氮处理最高,铵硝配比为30%:70%的处理次之。烟叶感官质量以铵硝配比为30%:70%的处理最佳,铵硝配比为50%:50%的处理次之。烟叶产值以铵硝配比为50%:50%的处理最高,铵硝配比为30%:70%的处理次之。在本试验条件下,兼顾品质和效益的铵硝配比为30%:70%或50%:50%。     

植物中氮素利用及硝态氮转运蛋白的研究进展

硝态氮转运蛋白在植物吸收利用氮素方面发挥主要功能,植物生长发育过程中对氮素的吸收、转运和再利用都需要硝态氮转运蛋白参与调控。目前硝态氮转运蛋白主要分为四类:NRT1(NPF)、NRT2、SLAC/SLAH、CLC。硝态氮在植物吸收、代谢和基因表达方面是一种很重要的信号调控分子,硝态氮转运蛋白可作为植物的硝态氮受体。通过论述氮素代谢过程中硝态氮转运蛋白家族基因的功能和在拟南芥等作物中的研究现状,为作物的抗逆性研究和优良品种的培育提供参考。     

甜菜谷氨酰胺合成酶基因在不同氮素条件下的表达分析

采用半定量RT-PCR技术对甜菜胞液型谷氨酰胺合成酶（GS1）和质体型谷氨酰胺合成酶（GS2）基因进行mRNA的表达检测,同时进行谷氨酰胺合成酶活性的测定,研究不同氮素处理对谷氨酰胺合成酶（GS）基因表达的调控,并以三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照进行基因表达水平的半定量分析。结果显示,NO3^-：NH4^＋〉1和NO3^-：NH4^＋=50：50较NO33^-：NH4^＋〈1更能促进GS活性;NO33^-：NH4^＋=80：20和NO3^-：NH4^＋=50：50较NO3^-：NH4^＋〈1更能促进GSI基因的表达;NO3^-：NH4^＋〉1和NO3^-：NH4^＋=50：50较NO3^-：NH4^＋〈1更能促进GS2基因的表达。说明硝态氮比例较高的混合态氮较铵态氮比例较高的混合态氮及单一铵态氮更能促进GS活性和GS基因的表达,氮素能有效地在转录水平上调控甜菜幼苗叶片GS基因的表达。     

茶树NPF5基因克隆及其在不同氮素处理下的表达

NPF转运蛋白家族在植物转运硝态氮过程中起重要作用。为明确茶树中NPF基因的序列特征,用PCR扩增的方法在茶树中分别扩增出一个茶树氮转蛋白基因CsNPF5的DNA和cDNA全长,为2 096,1 440 bp。序列分析指出,该基因含有3个外显子和2个内含子,开放阅读框(ORF)为1 440 bp。序列分析结果显示,该基因编码479个氨基酸,相对分子质量约为53.12 ku,等电点为7.13,其编码蛋白的N端含有一个PTR2 Pfam结构域;亚细胞定位分析指出该基因编码蛋白定位于细胞质内;CsNPF5蛋白与中华猕猴桃NPF蛋白具有较高的同源性,相似度为79.54%;聚类分析指出,CsNPF5及其同源蛋白分别聚类成3个进化分支,且与来自中华猕猴桃NPF18同源蛋白聚到同一进化支上。同时qRT-PCR分析结果表明,在0～48 h氮素处理下CsNPF5在叶中的表达存在不同程度的上调表达,且基因上调表达丰度随NO^-₃浓度升高,响应时间更快,且在2 mmol/L NO₃^-处理24 h后,CsNPF5在茶树叶片中...     

小麦应答低磷的钙依赖蛋白激酶基因TaCPK1A和TaCPK10的克隆和表达

采用构建富集磷胁迫特异表达基因cDNA差减文库、序列分析和cDNA-AFLP技术,鉴定了2个应答低磷胁迫的钙依赖蛋白激酶(CDPK)基因的表达序列标签。克隆、测序和比对结果表明,上述基因分别为TaCPK1A和TaCPK10。其cDNA长度分别为2 129 bp和1 696 bp,开放阅读框分别为1 599 bp和1 281 bp,分别编码532和426个氨基酸;具有CDPK的典型结构特征。系统进化分析表明,上述基因的核苷酸序列同源性低,分别来自不同的祖先。在对低磷胁迫的响应上,TaCPK1A在磷胁迫1~24 h范围内根系内的表达水平不断增强,叶内表达水平在1 h内明显被诱导,以后保持稳定;TaCPK10在相应磷胁迫时间范围根叶内的表达水平均呈低—高—低变化,在磷胁迫1 h的表达被诱导,以后又逐渐降至胁迫前水平。TaCPK1A和TaCPK10对氮、钾胁迫没有应答响应。结果表明,CDPK在介导小麦低磷胁迫的信号转导中具有重要作用,小麦中存在两种或多种CDPK介导的磷酸化过程参与低磷信号的转导。     

甘蓝型油菜铵转运蛋白基因家族成员的鉴定与表达分析

了解异源四倍体甘蓝型油菜中AMT基因家族的功能,为进一步克隆和利用基因改良甘蓝型油菜的氮素利用效率和铵毒抗性提供一定的理论基础。利用生物信息学的方法鉴定出20个BnaAMTs基因,其中14个为AMT1亚家族成员,6个为AMT2亚家族成员,它们不均匀地分布在油菜的12条染色体上。进化与保守基序分析结果表明,BnaAMTs蛋白亚家族内的蛋白质序列保守性较高,但亚家族之间的差异较大。BnaAMTs基因在油菜不同组织中的表达谱显示,该基因家族表达具有组织特异性。利用转录组测序结果分析发现,根部在供应高浓度的铵态氮和硝态氮时,BnaA7.AMT1;3表达量最高;在硝态氮缺乏条件下,BnaA5.AMT1;1表达量最高;在上述几种处理下,BnaC6.AMT1;1都是地上部表达量最高的拷贝。在缺硼或缺磷条件下,油菜BnaAMTs基因整体呈现表达上升的趋势;但在盐胁迫条件下,表达量下降;镉胁迫对BnaAMTs基因的表达影响较小。这些基因可能在铵态氮与其他必需营养元素的互作、镉胁迫、盐胁迫等逆境响应中发挥一定的作用;并为进一步深入解析甘蓝型油菜AMT家族基因的分子功能奠定了基础。     

小麦脂质转运蛋白cDNA结构及相应肽链构造特征的分析

根据测序获得的1条261 bp cDNA片段,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217(Pm2)的cDNA中扩增获得1条651 bp的cDNA片段,通过同源比对发现其包含小麦LTP1 完整的编码序列.该片段包含基因的5'非翻译区42 bp,3'非翻译区261 bp,开放阅读框348 bp,编码115个氨基酸.预计蛋白的分子量为11.2 kD,等电点为9.46.此基因有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及25个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY796184(基因)和AAV65513(蛋白).通过疏/亲水性分析,发现肽链分子具有较大范围的疏水面.     

海岛棉纤维发育相关基因GbPDF2酵母单杂交文库构建及其上游基因解析

为研究棉纤维起始发育的分子调控网络,以海岛棉(Gossypium barbadence L.)品种"海渝"开花当天(0 DPA)胚珠为实验材料,利用酵母单杂交技术来筛选棉纤维起始发育相关基因GbPDF2的上游调控转录因子。首先,克隆GbPDF2的启动子(Accession:KJ475468);构建了该启动子的诱饵融合载体(GbPDF2-PRO)-pAbAi,转入酵母细胞中重组为Y1HGold[Bait-pAbAi]菌株。之后,应用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System系统构建酵母单杂交cDNA文库,转化重组酵母菌株,通过同源重组筛选GbPDF2的上游转录调节因子。构建的cDNA文库库容为2.23×106,重组率为95.8%,插入片段大小为300 bp~2000 bp,其中大于1000bp的阳性克隆为109个。cDNA插入片段经测序和Blast同源性分析,筛选出2个生长素响应因子,1个WRKY7转录因子,1个WD-repeatprotein 40等与纤维发育相关的转录调节因子,为研究棉纤维起始发育的信号转导通路奠定了基础。     

辣椒Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列的克隆及分析

以辣椒属5个栽培种叶片为试材,利用Ty1-copia类逆转座子逆转录酶的保守序列设计简并引物,PCR扩增后均获得了260bp左右的目的条带。对C.annuum的扩增产物进行纯化、克隆和测序,经Mega4和DNAstar软件分析后,获得25条逆转录酶序列,核苷酸序列长度变化范围为225～272bp,这些序列存在高度的异质性,主要表现为缺失突变,同源性范围为23.1%～93.2%,核苷酸聚类分为7个组。翻译成氨基酸后,有9条序列存在1～3个不同程度的终止密码子突变,4条序列存在移框突变。将这25条逆转录酶的氨基酸序列与已发表的不同物种同一类型逆转座子的逆转酶序列进行聚类分析,表明辣椒的Ty1-copia型逆转座子与烟草、矮牵牛、马铃薯有很近的关系。     

大豆吡哆醛激酶基因的克隆与表达分析

以拟南芥吡哆醛激酶基因(PK)的蛋白质序列为信息探针,对大豆(Glycine max)EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为1102 bp的大豆吡哆醛激酶基因的cDNA序列,经RT-PCR克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列一致(GenBank登录号为DQ006813).该eDNA序列的开放阅读框(0RF)位于第119～1045位,推测编码308个氨基酸.采用半定量RT-PCR方法研究了该基因的组织特异性表达情况和对强光逆境的反应,结果表明该基因在大豆根茎叶中都有表达,对强光逆境不敏感.将大豆PK基因编码的蛋白序列与马铃薯(Solanum tuberosum,AAY85186)、拟南芥(Arabidopsis thaliana,AAK94021)、水稻(Oryza sativa,ABA99785)、小麦(Triticum aestivum,AAR00318)和油菜(Brassica napus,ABE73472)的吡哆醛激酶蛋白序列进行比对,发现其一致性分别为:81%,75%,78%,79%和76%.比对结果说明在植物中该基因编码的蛋白质存在显著的相似性.根据蛋白比对结果绘制的系统发育树基本代表了它们在经典分类上的地位.     

羊驼垂体催乳素（PRL）基因全长cDNA的克隆及序列分析

[目的]获得并分析羊驼PRL基因cDNA全序列结构,为研究羊驼催乳素（PRL）的各种生物学作用和生产应用提供理论依据。[方法]根据已知的不同哺乳动物的PRL基因cDNA序列,设计羊驼PRL引物,运用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增（RACE）技术获得羊驼PRL基因cDNA全序列。[结果与结论]羊驼PRL基因cDNA序列全长959bp,编码区为687bp,编码229个氨基酸的PRL前体蛋白。预测羊驼PRL蛋白质的空间结构类似人生长激素（GH）,但在81位（成熟肽为51位）为蛋氨酸可能导致蛋白空间结构的不同而影响羊驼PRL的功能;序列比对结果表明,羊驼PRL的 cDNA序列与大多数哺乳动物相似。构建的基因进化树分析结果显示,羊驼PRL与骆驼的亲缘关系最近;同多数哺乳动物一样,羊驼PRL进化速度极缓慢,没有发生人、灵长类、啮齿类、反刍动物的“episodic”式进化。     

羽衣甘蓝泛素结合酶ubc7基因分离、原核表达及纯化

为分离羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala)自交不亲和系(S13-bS13-b)泛素结合酶7(ubc7)基因,探讨Ubc7重组蛋白的原核表达及纯化。利用CTAB的方法提取羽衣甘蓝柱头总RNA,通过RT-PCR的方法分离ubc7基因,将编码ubc7基因的cDNA序列亚克隆到pET-14b原核表达载体中,将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS中,利用IPTG进行诱导表达,并通过Ni2+-NTA树脂进行亲和层析的方法纯化重组蛋白。结果表明,获得的Boubc7含有一个长度为501 bp的开放读码框,编码一个含有166个氨基酸残基的蛋白质。预测BoUbc7的相对分子质量约为18.7 kDa,理论等电点(pI)为5.35。利用IPTG诱导的细菌蛋白中,SDS-PAGE显示出在分子量大小23 kDa处有蛋白特异性的表达,这与预测的His6融合的BoUbc7蛋白分子量相符;利用Ni2+-NTA树脂进行亲和层析纯化后,成功获得了BoUbc7融合蛋白。该试验分离了羽衣甘蓝ubc7基因,并通过原核表达系统获得了BoUbc7重组蛋白,为进一步分析其生物学功能奠定了基础。     

利用 DDRT-PCR 鉴定芸芥自交不亲和系与自交亲和系的差异表达 cDNA

芸芥与芸薹属植物具有亲缘关系,也是芸薹属植物的重要育种资源。自交亲和性是芸芥的一种重要变异性状。为了探明芸芥自交亲和基因的表达器官,并分离与自交亲和性有关的 cDNA 片段,以芸芥的一对近等基因系,自交亲和系（SC）与自交不亲和系（SI）为试材,利用差异显示 RT-PCR 技术分别对开花前和开花后的叶片、花药和柱头进行鉴定。结果表明,不论开花前还是开花后,芸芥自交亲和系与自交不亲和系的叶片或花药间的扩增带型是一样的,但在近等基因系的柱头间得到了差异表达条带。这证明芸芥自交亲和基因不是组成型表达,而是组织特异性表达,柱头是其唯一的表达器官。在开花前的自交亲和系中共得到了2条 cDNA 片段,一条小于100 bp,另一条为750～1000 bp,在开花后的自交亲和系中得到了1条300 bp 的 cDNA 片段。据分析这3条 cDNA 片段可能与芸芥的自交亲和性密切相关。在开花前的自交不亲和系中共得到了2条 cDNA 片段,一条为500 bp,另一条为750 bp,同时在开花后的自交不亲和系中得到了1条500～600 bp 的 cDNA 片段。这些 cDNA 片段可以用来区分芸芥的自交亲和系与自交不亲和系,还可用于克隆自交亲和基因。     

用mRNA差别显示方法分析黑麦盐胁迫下应答基因cDNA片段的表达特性

利用mRNA差别显示方法分析经250mmol/LNaCl处理3d的黑麦幼苗,14个差异cDNA片段,包括8个诱导表达片段,2个增强表达片段和4个抑制表达片段被检测到.NorthernBlot分析证实,其中0.8kb、0.65kb和0.35kbcDNA片段有强烈阳性信号,命名为SI800、SI650、SI350(SaltInduced800bp、650bp、350bp),证明与盐胁迫有关.以SI800为探针与分别经     

小麦和水稻auxin基因家族的生物信息学比较分析

根据测序获得的1条260 bp cDNA片段,通过预测发现其包含小麦植物生长素(AUXIN)基因的部分编码序列,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217的cDNA中扩增获得一条608 bp的cDNA片段,该基因序列数据库(GenBank)登录号为AY902381(基因)和(蛋白).编码202个氨基酸,预计蛋白的分子量为23.0 kDa,等电点为9.93.利用已经分离的小麦生长素(AUXIN)基因的保守序列为检索序列,对小麦和水稻中的AUXIN基因家族成员进行分析,利用这些基因编码蛋白序列构建系统发生树,查找在GenBank的EST数据库中查找这些基因的ESTs表达序列,分析了这些基因在细胞中的定位情况和蛋白结构的相似性,根据已知相似基因的功能,分析该基因有进一步深入研究的必要.     

玉米ClpR2同源基因PL5L15的克隆及其在不同光周期处理下的表达分析

光周期敏感是热带、亚热带玉米种质在温带地区利用的主要障碍。本研究在构建的受长日诱导特异表达的差减文库基础上,以热带玉米CML288为材料,克隆了库中一个基因PL5L15的cDNA序列。该cDNA全长1410bp,具有879bp完整的ORF阅读框,编码一条292个氨基酸残基的肽链,包含一个Clp蛋白家族保守的Clp-protease结构域,是玉米Clp蛋白酶家族的ClpR2-LIKE基因,位于第9染色体上。Real-timePCR分析显示,在短日条件下该基因正常水平的表达有利于生殖分化,而在长日条件下持续过量高表达,推测该基因可能与玉米光周期反应过程中的生殖分化有关。