仔猪大肠杆菌和C型产气荚膜梭菌的毒力研究

为了确定不同纤毛抗原的猪大肠杆菌和C型产气荚膜梭菌引起试验动物发病的最小菌(毒)含量,用不同菌数的E.coliC83549(K88)、C83644(K99)和C83710(987P)菌株培养物对出生18～24h的仔猪进行攻毒,用不同毒素含量的C型产气荚膜梭菌毒素分别对出生18～24h的仔猪和家兔进行攻毒。结果表明,引起仔猪发病的大肠杆菌三种菌株的最低含量均为150×108CFU,C型产气荚膜梭菌引起1日龄仔猪和家兔发病的最低毒素含量分别75和80小鼠MLD。     

仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的研制与应用

为了研制仔猪大肠杆菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗,将大肠埃希菌C83549(K88)、C83644(K99)、C83710(987P)菌株和C型产气荚膜梭菌C59-2菌株分别接种适宜培养基,提取大肠埃希菌纤毛和C型产气荚膜梭菌外毒素,灭活和脱毒后加入冻干保护剂,冷冻干燥制成冻干灭活疫苗。该疫苗性状为类白色海绵状疏松团块,无菌检验合格,疫苗对仔猪和怀孕母猪安全,怀孕母猪免疫该疫苗后所产仔猪对大肠埃希菌和C型产气荚膜梭菌的攻毒保护率均在80%以上。临床应用结果表明,该疫苗能明显提高免疫母猪的窝平仔猪成活数。     

鸡抗猪大肠杆菌高免卵黄抗体的研制与应用

应用仔猪大肠杆菌标准菌株和地方分离菌株免疫商品蛋鸡，收获高免蛋制备多价卵黄抗体。经预防、攻毒试验及临床治疗效果观察，对仔猪免疫保护率可达90％以上，攻毒保护率98％以上，临床治愈率95％以上。     

不同猪瘟疫苗对18周龄猪群预防野毒攻击的疫苗效果对比研究

目的:探讨不同种类的猪瘟疫苗针对18周龄猪群在野毒攻击中的预防效果观察。方法:随机选取30头不患有蓝耳病的仔猪,并将其分成3组,对照组中的仔猪不接种任何疫苗,C1和C2为观察组,其中C1在仔猪为3周龄时接种4种不同的免疫疫苗,C2在仔猪为5周龄时接种4种不同的免疫疫苗,在仔猪达到18周龄时,给每头仔猪注射猪瘟野毒,并在攻毒0,8,15天时采集这三组仔猪的血样进行CME检测。结果:对照组中的仔猪在攻毒为8至11天时全部死亡,在C1组中有5头仔猪在攻毒11至36天时,C2组在攻毒36天之内都没有出现死亡的现象。结论:不同种类的猪瘟疫苗针对18周龄猪群在野毒攻击中的预防作用在细胞免疫应答方面都有着不同的免疫效果。     

仔猪水肿病蜂胶佐剂多价灭活苗的研制Ⅱ免疫保护期和疫苗保存期试验

对仔猪水肿病蜂胶佐剂多价灭活苗进行了免疫产生期、免疫持续期和疫苗保存期试验。研究表明 :仔猪接种该疫苗 5～ 7d后便产生免疫力 ,到第 9天时抗体产生水平已经很高 ;以免疫仔猪攻毒后的存活率不低于 95%为标准 ,疫苗的免疫持续期可达 9个月以上 ;以物理性状合格和免疫仔猪攻毒后的存活率不低于95%为标准 ,疫苗置 4℃时保存期为 1 8个月 ,2 5℃保存 9个月为宜     

猪圆环病毒2型感染对仔猪免疫功能的影响

为研究猪圆环病毒2型(PCV2)对宿主免疫应答的动态影响,选取19头PCV2和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)血清抗体阴性的普通断奶仔猪,随机分为对照组(4头)和试验组(15头),试验组每头仔猪接种PCV2病毒悬液,分离攻毒后0、3、7、14、21、28和35 d仔猪外周血淋巴细胞和血清,用MTT法检测外周血淋巴细胞的转化率,并用ELISA法检测血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-6和IL-10的表达变化。结果显示,脂多糖(LPS)刺激下仔猪外周血淋巴细胞的转化率在攻毒后各时间点均极显著降低(P0.01);植物血凝素(PHA)刺激下仔猪外周血淋巴细胞的转化率在攻毒后3、21和28 d极显著降低(P0.01),在攻毒后14 d显著降低(P0.05);与对照猪相比,攻毒猪血清中IL-6的含量在攻毒后各时间点均无显著变化(P0.05);IL-1β的含量在攻毒后7 d显著升高(P0.05),IL-10的含量在攻毒后35 d极显著升高(P0.01);IL-2的含量在攻毒后7 d显著降低(P0.05),在攻毒后21 d显著升高(P0.05),在攻毒后28和35 d均极显著升高(P0.01)。结果表明,PCV2能显著抑制仔猪外周血T、B淋巴细胞的转化能力,并能激活机体的固有免疫应答,但同时能导致适应性免疫应答的活化出现迟滞并在攻毒后期引起免疫调节紊乱。     

致仔猪水肿病大肠杆菌减毒株的毒力测定及其在仔猪肠道内增殖的分析

在已构建致仔猪水肿病大肠杆菌S451521菌株的2个毒素敲除菌株（F1、F2）基础上,进一步测定了其毒力及在仔猪肠道内的繁殖能力。选择30日龄的ICR小鼠并随机分成4组,A、B、C试验组分别灌胃接种不同浓度的野生菌株S451521及其毒素敲除菌株F1、F2,D组以灭菌生理盐水作阴性对照;结果表明减毒菌株F1和F2毒力均比野生菌株弱,其中F1株减弱了60.73%、F2株减弱了84.38%。选择24日龄未经仔猪水肿病疫苗免疫过的仔猪共14头,并随机分为2组;第1组口服接种减毒菌株F2,第2组以灭菌生理盐水作阴性对照,定期采集仔猪粪样并进行细菌监测;结果显示,仔猪排出减毒菌株F2的数量随时间不断增多,在接种后28d可达到每克粪样含目的菌约70 000cfu。这说明减毒菌株F2能够在仔猪体内定植并大量繁殖。     

副猪嗜血杆菌TbpA对仔猪的免疫效力评价

本研究旨在了解副猪嗜血杆菌(HPS)转铁结合蛋白A(TbpA)对仔猪的免疫保护性,从而为HPS新型疫苗的研发奠定基础。采用HPS血清型13型灭活全菌体以及浓度分别为0.5、0.25mg·4mL~(-1)的重组TbpA,经3次间隔期均为14d的免疫后,检测仔猪抗体(IgG)水平及细胞因子(IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α)水平;以相同血清型菌株7LD50剂量,腹腔攻毒,检查病理学变化及其免疫保护率。结果显示:HPS的重组TbpA能诱导仔猪产生较高水平的特异性抗体IgG,并使细胞因子显著升高。重组TbpA和灭活全菌体在免疫后均能使仔猪获得免疫保护,其中0.5mg·4mL~(-1) TbpA和灭活全菌体的免疫保护率均为100%,组织切片病理变化与攻毒对照组之间差异明显。HPS的TbpA能激发仔猪的体液免疫和细胞免疫,产生较强的免疫保护力,可以作为一种新的疫苗候选抗原。     

仔猪副伤寒活疫苗生产工艺的改进

仔猪副伤寒活疫苗是由抗原性良好的猪霍乱沙门氏菌强毒株在含有醋酸铊的普通肉汤中传代培养,经传数百代后,筛选出1株毒力弱而免疫原性良好的弱毒菌株,命名为猪霍乱沙门氏杆菌C500弱毒株。     

猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)对兔与猪免疫攻毒保护平行关系的研究试验

用研制的连续3批猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)分别以不同剂量免疫健康兔和断奶仔猪,检测其免疫28 d后的血清抗体,采用血清中和试验法测定血清中和指数,并对免疫28 d后的兔和断奶仔猪分别进行攻毒,统计各组兔和断奶仔猪免疫后攻毒保护率。结果表明,兔免疫28 d后的血清抗体中和指数为794～1258时保护率为60%～80%,血清抗体中和指数≥1479时可获得100%保护;仔猪免疫28 d后的血清抗体中和指数为229～269时保护率为60%～80%,血清抗体中和指数≥331时可获得100%保护。兔与仔猪对猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)均产生良好的免疫应答反应,抗体值较高者获得保护率相对较高,兔与猪免疫与攻毒保护呈现平行关系。     

猪霍乱沙门菌C500运载猪瘟病毒新型基因疫苗在家兔体内的免疫应答

为研究猪霍乱沙门菌C500(S.C500)运载猪瘟病毒(CSFV)新型基因疫苗口服免疫家兔的体内免疫应答特点,采用电转化法将CSFV新型基因疫苗转化到S.C500,构建重组工程菌,口服免疫接种家兔,检测CSFV、S.C500特异性抗体;并用猪瘟兔化弱毒疫苗及猪伤寒沙门菌野毒株依次进行攻毒试验。结果显示,成功构建CSFV新型基因疫苗重组菌S.C500/pCB-ME2-IL-15,S.C500/pCC-ME2-IL-15。口服免疫家兔可以诱导产生抗CSFV和S.C500的特异性ELISA抗体,且S.C500/pCC-ME2-IL-15略显优势。经三免后免疫家兔能够部分抵抗猪瘟兔化弱毒疫苗与猪伤寒沙门菌野毒株的攻击。试验提示以S.C500为CSFV新型基因疫苗运载体的猪用重组活菌苗具有可行性。     

禽流感H_5和H_9混合疫苗免疫肉鸽的效果试验

将禽流感H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-4＋Re-5）和H9亚型（SS株）灭活疫苗等量均匀混合,采用不同剂量不同次数分别注射。用血凝和血凝抑制试验方法检测H5亚型（Re-4、Re-5）和H9亚型（SS株）抗体效价。试验表明：以较小剂量0.5ml/只,间隔21d二免能产生整齐、持久、高滴度保护抗体,据此提出鸽H5和H9亚型禽流感多价混合疫苗的参考免疫程序。     

鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病三联弱毒疫苗的试制

用同胚培养的鸡新城疫Lasota株和传染性支气管炎H120（或H52）株以及用鸡胚成纤维细胞增殖的传染性法氏囊弱毒株以适当比例混合为抗原,用蔗糖脱脂乳作保护剂,经真空冷冻干燥制成三联弱毒疫苗。通过三批疫苗室内外各项指标的测试,表明该三联疫苗安全性能可靠,免疫效果确实,使用方法简便。在实验室进行的物理性状检验、无茵检验、支原体检验、剩余水分检验、真空度检查均符合国家标准;用10倍大剂量接种15日龄雏鸡无不良反应;以常规量颈部皮下接种免疫后,7d产生免疫力,免疫后14d抗鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊病三株强毒攻击的保护率均为,100％。对15日龄雏鸡首免,其免疫期至少为30d,在-25℃保存期为1年。     

国内现有猪口蹄疫O型灭活疫苗对2010年流行毒株的抵抗力

在2010年上半年,猪O型口蹄疫不断发生,作为国内几个生产厂家的猪口蹄疫现用疫苗种毒的提供者,我组进行了猪源流行毒对该种毒灭活疫苗免疫猪的攻毒保护试验及观察。结果如下:1)、猪源流行毒致猪发病速度慢。猪源流行毒接种猪后,致猪发病的时间在3～5天,而疫苗株致猪发病时间是接种后2～3天;2)、该疫苗毒株能有效抵抗猪源流行毒的攻击,PD50大于6;3)、免疫保护和ELISA抗体水平没有线性相关性;4)、免疫保护与140S抗原量有相关性。     

猪伪狂犬病不同佐剂灭活疫苗对兔免疫原性初探

采用分离鉴定的猪伪狂犬病毒（HB—J株）以4种佐剂研制成4批灭活疫苗,以研究其对兔的免疫原性。疫苗分别免疫PRV抗体阴性兔后,用乳胶凝集试验法（LAT）和中和试验法（SNT）对试验兔进行血清抗体检测;于免疫后21、28d对试验兔分别进行攻毒,观察兔保护情况。试验结果表明,兔对不同佐剂的猪伪狂犬病疫苗均产生良好的免疫应答反应,且当兔免疫后血清凝集价≥1：32或血清抗体中和指数≥1479或中和价≥1：16时,可以抵抗10LD50剂量强毒的攻击;当兔免疫后血清凝集价≥1：64或血清抗体中和指数≥2187或中和价≥1：32时,可以抵抗100LD50剂量强毒的攻击;4种佐剂灭活疫苗均具有良好的免疫效果。     

内蒙古地区牛羊口蹄疫灭活疫苗的免疫效果比较研究

为准确掌握牛羊口蹄疫疫苗免疫效果,2012年对内蒙古自治区的牛羊口蹄疫O—AsiaI型双价灭活疫苗和牛羊口蹄疫A型灭活疫苗免疫效果进行了监测。采用液相阻断ELISA方法。共检测了8个旗县23018份免疫牛羊口蹄疫O—AsiaI型双价灭活疫苗和牛羊口蹄疫A型灭活疫苗15日、30日、60日的血清中口蹄疫免疫抗体水平。结果显示,牛羊口蹄疫疫苗免疫效果总体良好,免疫抗体合格率超过了70％。规模化奶牛养殖场免疫效果稳定,散养地区免疫效果稳定性差,且不同厂家的疫苗免疫效果不同,加强免疫后A、B、D三个厂家抗体合格率能达到100％,C厂家的免疫效果较差,抗体合格率为93-3％。采用3ABC—ELISA检测试剂盒对部分地区牛羊进行感染抗体检测,结果为阴性。     

禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术（SOE-PCR）获得了融合基因22-agS5B,将基因连接于表达载体pET32a（＋）,构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1mmol／L）诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。     

微小隐孢子虫抗原CTL细胞表位预测及多表位基因的原核表达

应用多个服务器对微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析,预测可能存在的CD8＋细胞毒性T细胞（CD8＋cytotoxic T lymphocyte,CD8＋CTL）表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因中选出10个分值较高的表位基因串联在一起,形成一条多表位基因,进行人工合成,表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接,命名为CpCTL10。将该多表位基因重组入高效融合表达载体pET-28a（＋）,获得重组质粒pET-28a（＋）-CpCTL10,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE、Western blot分析。结果显示,CpCTL10基因在大肠杆菌中主要以包涵体形式高效表达,表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55．3％,纯化的重组蛋白纯度达75．1％。Western blot分析显示表达产物能与感染隐孢子虫的鼠阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组蛋白具有较好的抗原性,为多抗原多表位疫苗的研制打下某础．     

基于SYBR Ⅰ实时荧光定量PCR对猪流行性腹泻病毒野毒和疫苗弱毒鉴别诊断方法的建立

本研究参考GenBank中登录的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)野毒株和弱毒疫苗株(CV777弱毒疫苗株)在高度保守ORF3基因核苷酸序列的差异,设计一对特异性荧光定量引物,分别建立基于SYBRⅠ实时荧光定量RT-PCR方法。结合熔解曲线分析可见,其野毒株和弱毒疫苗株熔解温度(Tm)分别为(81.84±0.17)℃和(83.16±0.14)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现1个单特异峰,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号。结合熔解曲线可直接鉴别猪群中PEDV的感染情况和程度,可对免疫猪群PEDV野毒感染和疫苗免疫做出快速准确的鉴别诊断,尤其是对PEDV弱毒疫苗免疫后仍爆发PEDV野毒感染的研究更有临床意义。