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相似文献
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1.
用EcoRI酶切PR5B4质粒,采用“V”字形内槽电洗脱法回收约0.804Kb牛冠状病毒基因工程抗体4H12/1D4单链基因片段,并将其插入载体质粒PET-17b的EcoRI位点构成重组质粒PET-D4,将重组质粒转化DH5α感受态细胞,在IPTG的诱导下表达,细菌裂解物经SDS-PAGE电泳筛选,发现含PET-D4细菌经诱导新增一条约28KDα蛋白带,该蛋白带与设计基因工程抗体的大小相符,经光密度扫描,表达量约占菌体总蛋白的14%  相似文献   

2.
利用电脉冲交质粒pHT3101和pHE-4D分别转入大肠杆菌和苏云金杆菌,结果显示大肠杆菌DNA的转化率为10^4-10^5.μg^-1,苏云金杆菌的DNA的转化率为10^2-10^3.μg^-1,同时利用该法消除Escherichia coli菌株TG1和Bt菌株ISP78/11中的pHT3101质粒,消除率分别为88.6%和66.4%。比较了转化和质粒消除的条件并构建了一个工程菌。  相似文献   

3.
用粘端连接法将构建于Escherichia coli FDB213菌檄中的玉米谷氨酰胺合成酶(MGS)c-DNA亚克隆于由农力质粒改造的PBI121载体中。测定的72个转化菌中7株(9.2%)插入MGSc-DNA片段。亚克隆后的质粒DNA用HindⅢ和BstxI酶解可确定其c-DNA片段的插入方向。结果显示:P9、P15、P16与P17为正向插入,P2为反向插入的菌株。P6质粒DNA进一步用直接基  相似文献   

4.
应用聚合酶链反应(PCR)对畜型和禽型两个融合基因HBsAg/LHRH的5′端分别作了改造,切去了融合基因起始密码ATG前一段非编码序列61个碱基,将改造后的融合基因插入pBluescripe11KS+质粒中。琼脂糖凝胶电泳以及序列分析均表明改造和克隆成功。将改造后的融合基因克隆到含T7Promoter强启动子的表达载体pET15b中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在E.coliDE3中表达,表达量占菌体总蛋白的10%,以兔抗LHRH抗体进行Western-blot检测,出现阳性反应带。用抗HBsAg抗体作ELISA检测,结果稀释1×10-6时仍为阳性反应。  相似文献   

5.
家蚕核多角体病毒Lef—1和DA26基因的克隆及部分序列分析   总被引:2,自引:1,他引:2  
lef-1和DA26基因分别位于egt基因的上游和下游.从pUAc-egt中分离出EcoRI-XbaI1.1kb的egt基因片段,进行缺口平移标记,获得探针。与BmNPVDNA经HindⅢ酶切、电泳、转移至NC膜的DNA进行Southernblot杂交,发现BmNPVDNA的HindⅢD片段呈阳性。从BmNPV基因组中分离出10.4kb的HindⅢD片段,用EcoRI酶切得到HindⅢ-EcoRI2.2kb、EcoRI1.4kb和EcoRI-HindⅢ6.8kb3个片段,分别克隆于pUC19中,命名为pUHE2.2、pUE1.4和pUEH6.8。经双链测序并与AcNPV相关基因序列进行比较,发现lef-1基因被克隆于pUHE2.2中,DA26基因克隆于pUEH6.8中。从所测定的lef-1和DA26基因的启动子及5'端部分序列来看,它们在AcNPV和BmNPV之间有极高的同源性。  相似文献   

6.
尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
将人尿激酶原基因cDNA分别插入到真核表达载体pcDNA3的CMV启动子和pSV2neo的SV40启动子下游,构建了重组表达质粒pcDNA3-UK和pSV-2-UK分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染BHK21细胞。ELISA检测结果表明,pcDNA3-UK和pSV2-UK在哺乳动物细胞中能够表达,72h表达量分别为28.7ng/ml和13.5ng/ml。  相似文献   

7.
将人尿激酶原(Pro-UK)基因cDNA分别插入到真核表达载体pcDNA3的CMV启动子和pSV2-neo的SV40启动子下游,构建了重组表达质粒pcDNA3-UK和pSV2-UK,分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染BHK21细胞。ELISA检测结果表明,pcDNA3-UK和pSV2-UK在哺乳动物细胞中能够表达,72h表达量分别为28.7ng/ml和13.5ng/ml。  相似文献   

8.
采用固相亚磷酸三酯法人工化学合成了人胰岛素样生长因子-Ⅰ(huIGF-I)基因的4条寡核苷酸 片段,再通过片段1、2与3、4末端互补配对和Klenow酶促补平及酶切连接成为完整的huIGF-IDNA片段,用 EcoR I/PstI酶切后克隆于 pGEM T-Easy Vector,经测序证明所得 DNA序列与设计的序列完全一致;选用植物 偏爱密码子校正了启始密码子ATG下游的6个密码子,并在ATG处增加Kozak序列后,插入pBI121的BamHI/ SacI位点,构建了以 35S为启动子的植物表达载体;以 Hind II/EcoRI切下“35S-Kozak-IGF-I-NOS(ter.)”插入 pCAMBIA2300之Hind II/EcoR I位点,构建成huIGF-I植物表达载体;通过CaCl2直接转化法将表达载体导入农 杆菌EHA105(Rif.r),并以菌落原位杂交技术和 DNA dot blot对重组农杆菌进行了筛选,所获得的重组农杆菌菌株为培育huIGF-I豆药用植物奠定了基础。  相似文献   

9.
人雄激素受体LBD基因融合表达产物的分离制备   总被引:1,自引:1,他引:1  
利用硫氧还蛋白事例表达系统,将编码人雄激素受体(hAR)激素结合区(LBD)的基因(编码hAB584-918氨基酸)插入质粒pTrx Fus中trxA基因的3′端,重组后的质粒pTrxAR导入E.coli GI724中,经Trp诱导,该转化的菌株表达一融合蛋白。通过制备包含体,再利用制备型SDS-PAGE或Sephadex G-200柱层析都可较好地纯化分离该融合表达产物(达到SOS电泳单点纯),  相似文献   

10.
烟叶超氧物歧化酶的研究   总被引:7,自引:0,他引:7  
从烟叶中提取的超氧物歧化酶(SOD),经PAGE垂直板电泳后,用氮蓝四唑(NBT)法活性染色,并经凝胶薄层扫描(λ=595nm),结果显示粗酶液有6条同工酶谱带,经纯化后的酶只有一条谱带。此纯酶液置冰箱36h后,可获得长方形结晶。结晶酶液用SephadexG-100柱层析(1.5cm×100cm)和SDS-和SDS-PAGE测得其分子量分别为24830和28900。用等电聚焦电泳测得该酶等电点为6.80。该酶在pH5~9范围内活性较稳定,在75℃保温15min活性尚保留54%。此酶对KCN、氯仿-乙醇不敏感,但受到EDTA,H_2O_2的强烈抑制,表明烟叶中分离纯化得到的SOD为酶分子中结合Fe的Fe-SOD。  相似文献   

11.
K88菌毛蛋白亚基基因克隆、表达及重组蛋白抗血清制备   总被引:5,自引:1,他引:4  
利用PCR技术,从仔猪黄痢的致病菌中扩增出不含信号肽序列的K88菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到E.coli表达载体pET28a(+)中,构建了该基因的原核表达载体p8828,导入E.coliBL21(DE3),得到工程菌株。DSD-PAGE分析结果显示,经IPTG诱导,该亚基基因高效表达出重组K88菌毛蛋白,约占菌体总蛋白的30%。用含重组蛋白的凝胶作为抗原,免疫新西兰大白兔,首次制备K88菌毛  相似文献   

12.
目的:从重组人Bcl-2质粒中制备对基因重组和DNA测序等有用的pBluescriptⅡKS(-)载体。方法:先将重组人Bc1-2质粒转化DH5α菌株,小规模制备此质粒DNA,然后从低熔点琼脂糖凝胶中回收其中用EcoRⅠ酶切的线性pBluescriptⅡKS(-)载体,用T4DNA连接酶催化连接并再次转化DH5α细菌,并用限制酶切鉴定,最后进行冻存和大量制备及纯化。结果:限制酶切分析证明两次转化的细菌分别是含重组人Bcl-2质粒和pBluescriptⅡKS(-)载体的工程菌。实验还大量制备了这两种质粒或载体DNA,并用聚乙二醇沉淀法进行了纯化。结论:利用分子生物学技术成功地从重组人Bcl-2质粒制备出pBluescriptⅡKS(-)载体。  相似文献   

13.
用经蔗糖密度梯度离心纯化的鸡传染性支气管炎病毒(IBV,M41)作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过常规淋巴细胞杂交瘤技术产生杂交瘤细胞,经ELISA筛选,获得了4株能分泌特异性抗IBV单克隆抗体的细胞系,分别命名为4AC1、4AF1、6DH8及2DH10。4株单抗的亚类都属于IgG2b,在Westernblotting试验中,4AF1、6DH82株单抗特异性地识别IBV的核衣壳蛋白(N);经ELISA测定,各株单抗40h培养上清效价达10-2~10-4,第7天腹水效价达10-5~10-6,4AF1、6DH8与所试7个IBV标准株及2个IBV分离株都发生反应  相似文献   

14.
诸葛菜基因启动子的分离   总被引:2,自引:0,他引:2  
利用启动子探针型载体pSUPV2首次从诸葛菜总DNA中克隆了7个具有启动功能的DNA片段,转化E.coli表明最高卡那霉素(kna)抗性为140μg/ml,最低为20μg/ml。含启动子片段的7个重组质粒子分别命名为pSUPZ1-7,Southren印迹表明pSUPZ6对Kna的抗性功能来源于诸葛菜的10kb,5kb和3.9kb片段。  相似文献   

15.
PuPR为含有编码人孕激素受体(hPR)激素结合区(LBD)基因(631-933氨基酸)的pUC19重建质粒,在其宿主Escherichia coli(BL21)中,经1mmol/L的IPTG诱导,该转化的细菌产生一C端为6×His结尾的蛋白质,分子量45KD。该表达产物可利用Ni-NTA HRP在ng水平用Westem印迹检测,并可通过亲和层析的方法,利用His-binding resin(Ni  相似文献   

16.
本文系统地研究了阴离子C12H25SO4Na(C12S),C12H25(OC2H4)7SO4Na(C12E7S)、阳离子C12H25N(CH3)3.Br(C12NMe3)和非离子C8H17.C6H4.(OC2H4)10OH(TX-100)表面活性剂对肌酸激酶(C.K.)活力的影响以及变性后的复性,结果表明,C12E7S和Tx-100对C.K.的活力破坏较小,C.K.经C12E7S和TX-100变性  相似文献   

17.
研究了将聚乙二醇用作相转移催化剂及其对亲核取代反应的改善,先将雌二醇经溴化制得2-或4-溴雌二醇,再分别氯仿中以聚乙二醇(PEG-400)作相转移催化剂(PTC)进行亲核取代反应制备2-呈4-甲氧基雌二醇,发现其适条件为:反应温度6-65℃,搅拌反应时间1.5h,试剂比例底物为甲醇:KOH:PEG=1:20:80:0.8,获得较高亲核取代产率;2-氧基雌二醇66.7%及4-甲氧基雌二醇70.3%,  相似文献   

18.
目的:从重组人Bcl-2质粒中制备对基因重组和DNA测序等有用的pBluescriptⅡKS(-)载体。方法:先将重组人Bcl-2质粒转化DH5α菌株,小规模制备此质粒DNA,然后从低熔点琼脂糖凝胶中回收其中用EcoR Ⅰ酶切的线性pBluescriptⅡKS(-)载体,用T4DNA连接酶催化连接并再次转化DH5α细菌,并用限制酶切鉴定,最后进行冻存和大量制备及纯化。结果:限制酶切分析证明两次转化  相似文献   

19.
应用聚全酶链反应(PCR)对畜型和禽型两个融合基因HBsAg/LHRH的5’端分别作了改造,切去了融合基因起始密码ATG前一段非编码序列61个碱基,将改造后的融合基因插入pBluescripe 11 KS^+质粒中。琼脂糖凝胶电泳以及序列分析均表明改造和克隆成功。将改造后的融合基因克隆到含T7Promoter强启动子的表达载体pET15b中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,在E.coliDE  相似文献   

20.
用融合表达质粒载体PGEXKT构建了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGMCSF)的表达质粒PGEXKT/GMCSF。质粒转化大肠杆菌后,经IPTG诱导,超声波裂解,谷胱苷肽琼脂糖亲和胶进一步纯化,表达的hGMCSF融合蛋白纯度达到80%以上,融合蛋白经凝血酶的作用后,再纯化,以MTT法测定纯化的hGMCSF活性,结果其活性达1.7×106单位/升菌液。  相似文献   

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