蛋白互作研究方法在水稻中的应用及主要互作数据库汇总

实验设计时选择合适的方法,有利提高科研效率。综述了多种研究蛋白质相互作用的方法,分析了各类方法的优缺点以及在水稻中的研究应用,归纳整理了现有的大型蛋白互作数据库。     

氮素吸收调控中铵转运蛋白与锚蛋白的互作研究

铵转运蛋白（AMT）介导的高亲和力铵跨膜运输是植物根系吸收铵态氮的主要途径。AMT蛋白水平上的调控能够快速有效地控制根系铵吸收能力,但参与调控的互作蛋白尚未见报道。本研究通过生物信息学手段预测得到铵转运蛋白AtAMT1;3可能和锚蛋白AtAnkTm8存在互作。基因表达分析实验发现AtAMT1;3和AtAnkTm8的根中组织特异性表达模式一致,并同时受到缺氮胁迫的上调表达,结果支持了它们互作的可能性。筛选鉴定出AtAnkTm8缺失突变体,分析在供铵条件下及对甲基铵敏感性的生长表型,结果发现AtAnkTm8的缺失没有影响拟南芥根的铵吸收能力,推测可能存在其他家族成员的功能冗余。AMT与AnkTm的互作为理解植物铵吸收调控过程提供了可能的新颖机制     

利用免疫共沉淀技术研究RSVCP、SP和NSvc4蛋白的互作

为了检测水稻条纹病毒(Rice sgipe virus,RSV)外壳蛋白(coat protein,CP)、病害特异蛋白(disease-special protein,SP)和可能的运动蛋白NSvc4自身和两两之间的互作关系,首先通过PCR扩增获得了分别融合有HA或c=Myc标签的RSV CP、SP和NSvc4基因,并将其插入到植物表达载体pEGAD或pKYLX71:35S2中.重组质粒转化根癌农杆菌(Agrobactctium tume-faciens)EHA105后,将含有不同重组质粒的根癌农杆菌菌液混合后注射烟草(Nicotiana benthamiana)叶片.提取烟草中瞬时表达的蛋白,以HA或c-Myc抗体进行免疫共沉淀试验,最后免疫混合物通过c-Myc抗体或HA抗体进行Western blot检测,确定蛋白的互作情况.结果表明,RSV CP蛋白自身能够发生互作,而CP与SP,CP与NSvc4,SP与SP,SP与NSvc4,及NSvc4与NSvc4蛋白之间均未有检测到互作现象.     

高羊茅FaGI基因在拟南芥中异源表达及蛋白互作分析

为探究高羊茅FaGI基因的生物学功能,本研究利用酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀探究与FaGI互作的蛋白;通过农杆菌介导法将过表达载体p1300-FaGI遗传转化拟南芥,获得转FaGI基因拟南芥株系,以拟南芥野生型Col-0、过表达FaGI基因株系和gi突变体为材料进行转录组学测序并观察其开花表型。结果表明,利用酵母双杂交方法筛选出与FaGI互作的FaCO蛋白,并通过双分子荧光互补和免疫共沉淀证明了FaGI和FaCO在体内和体外存在互作关系;过表达FaGI基因拟南芥植株的开花时间比野生型Col-0提前约1.24 d;将FaGI-OE、gi与野生型比对,分别筛选出1 963和92个差异表达基因（DEGs）,与野生型植株相比,过表达FaGI基因株系的差异基因富集在与生长发育、光周期途径、激素合成和信号传导、碳代谢等相关生物过程和代谢通路。综上,FaGI影响光周期途径相关基因的表达,在长日照条件下过表达FaGI基因促进了拟南芥开花,同时该基因的功能具有多样性与复杂性,可作为高羊茅调控分子育种的目标基因。本研究结果为揭示FaGI基因的功能及其调控网络奠定了基础。     

水稻赖氨酸和总黄酮含量的QTL定位及环境互作分析

为挖掘多环境下稳定存在的水稻赖氨酸和总黄酮含量相关QTL,以粳稻东农425和长白10号及其衍生的180个株系的F_(6:7)重组自交系(RIL)作为供试群体,采用完备区间作图法(ICIM)和基于混合线性模型的复合区间作图法(MCIM),对2014年和2015年水稻的赖氨酸含量和总黄酮含量进行加性QTL定位及环境互作分析。结果检测到10个影响赖氨酸含量的加性效应QTL和12个影响黄酮含量的加性效应QTL,分布在除第9、第10和第12染色体以外的9条染色体上,其中在第5染色体的RM538~RM1271标记区间内连续2年检测到总黄酮含量QTL。检测到6个存在环境互作效应的赖氨酸含量QTL、4个存在环境互作效应的总黄酮含量QTL,互作贡献率为0.15%~6.73%;一对影响总黄酮含量的上位互作效应的QTL,贡献率为0.99%。本研究结果为水稻赖氨酸和总黄酮含量QTL分子标记辅助育种提供了一定的理论依据。     

利用免疫共沉淀技术研究RSV CP、SP和NSvc4三个蛋白的互作情况

为了检测水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)CP、SP和NSvc4蛋白自身和两两之间的互作关系,首先通过PCR扩增获得了分别融合有HA或c-Myc标签的RSV CP、SP和NSvc4基因,并将其插入到植物表达载体pEGAD或pKYLX71:35S2中。重组质粒转化农杆菌EHA105后,将含有不同重组质粒的农杆菌菌液混合后注射烟草(Nicotiana benthamiana)叶片。提取烟草中瞬时表达的蛋白,以HA抗体或c-Myc抗体进行免疫共沉淀实验,最后免疫混合物通过c-Myc抗体或HA抗体进行Western blot检测,确定蛋白的互作情况。结果表明,RSV CP蛋白自身能够发生互作,而CP与SP,CP与NSvc4,SP与SP,SP与NSvc4,及NSvc4与NSvc4蛋白之间均未有检测到互作现象。     

与南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白P10互作的寄主因子筛选

为找到水稻中与南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)外壳蛋白P10(CP)相互作用的寄主蛋白,利用P10筛选水稻膜系统酵母双杂cDNA文库,寻找水稻中与P10互作的蛋白并结合生物信息学技术进行分析,回转验证.结果表明,筛选到10个可能与P10互作的水稻寄主蛋白,如胚发育晚期丰富蛋白Lea14-A、硫氧还原蛋白TRXh1、...     

烟草NtMYB4a基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选

为探究NtMYB4a是否与其他蛋白质发生互作,并共同影响烟草次生代谢产物的合成和响应非生物胁迫,通过构建NtMYB4a基因酵母双杂交诱饵载体,从烟草cDNA文库中筛选出与NtMYB4a互作的候选蛋白,并利用实时荧光定量PCR初步验证低温胁迫下候选蛋白和NtMYB4a的共表达关系。结果表明,从cDNA文库中初步筛选出39个与NtMYB4a互作的蛋白,经回交验证排除假阳性,最终得到6个与NtMYB4a具有互作关系的蛋白,分别是RALF-like 22蛋白、锌指A20/AN1结构域蛋白、液泡分选蛋白、天冬氨酸蛋白酶、B2蛋白和应激增强蛋白。在低温胁迫下,6种互作蛋白的基因表达量变化趋势与NtMYB4a相似,均呈升高—降低—升高的趋势。相关性分析发现,液泡分选蛋白、B2蛋白、RALF-like 22蛋白和应激增强蛋白基因的表达与NtMYB4a的表达呈正相关关系,锌指A20/AN1结构域蛋白和天冬氨酸蛋白酶基因的表达与NtMYB4a的表达呈较弱的负相关关系,推测NtMYB4a可能与这些蛋白互作参与烟草低温胁迫的防御调控。本研究结果为进一步探究NtMYB4a参与响应非生物胁迫的分子调控机制提供了依据。     

非生物胁迫诱导的棉花酵母双杂交文库构建及GhJAZ1互作蛋白筛选

非生物胁迫导致棉花生长发育受到抑制,严重影响棉花的产量和品质。为了深入探究棉花非生物逆境响应的分子作用机制并鉴定GhJAZ1的互作蛋白,本研究以陆地棉标准系TM-1为材料,采用Gateway重组技术构建了非生物胁迫诱导的陆地棉酵母双杂交cDNA文库,获得的初级文库总克隆数为1.2×10⁷ CFU,次级文库总克隆数为1.6×10⁷ CFU,重组阳性率100%,酵母文库滴度为5.0×10⁷ cells·mL^-1,酵母克隆平均插入片段>1 000 bp,符合建库标准,可用于后续酵母双杂交筛选。以GhJAZ1为诱饵,构建pGBKT7-GhJAZ1诱饵蛋白表达载体,经毒性检测及自激活活性检测,明确了诱饵质粒在酵母系统中无毒性和自激活活性,可直接用于酵母文库筛选。利用酵母双杂交筛选构建的非生物胁迫诱导的酵母cDNA文库,得到72个初筛阳性克隆,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得11个与GhJAZ1相互作用的候选蛋白。选取其中4个候选蛋白,利用酵母双杂交进一步确认了GhJAZ1与候选蛋白的相互作用关系。本...     

山葡萄VaCIPK18原核表达与多克隆抗体制备

类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)互作蛋白(CIPKs)作为类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应非生物胁迫信号转导中起着重要作用。基于前期山葡萄响应低温胁迫转录组测序结果,发现低温胁迫引发的早期伤害及感知阶段的激酶基因中涉及CBL-CIPK信号通路的VaCIPK18表达显著上调。为进一步研究山葡萄(Vitis amurensis)VaCIPK18激酶参与低温胁迫的功能,采用同源克隆获得了VaCIPK18基因,其开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。基于对VaCIPK18蛋白生物信息学分析,获取胞外结构域中抗原表位丰富的肽段,并将其C端调控结构域(230～439 aa)构建到原核表达载体pET28a-SUMO。将重组表达载体转化至大肠杆菌(E.coli Rosetta)中,经0.8 mmol·L^-1 IPTG、37℃诱导4 h表达出大小为42 kDa的包涵体蛋白。将重组蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得anti-VaCIPK18多克隆抗体,经检测具有高效价及特异性。Western Blot结果表明,该抗体可以与葡萄内源CIPK18特异性结合,且在50 k...     

嗜水气单胞菌外膜蛋白(OMP)在乳酸乳球菌中的表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护效果

乳酸球菌(Lactococcus lactis)是一种安全级微生物,为活载体疫苗传递抗原的理想选择.嗜水气单胞菌(A eromonas hydrophila,Ah)能引起鱼类等多种动物的败血病,因其血清型众多,寻找共同保护性抗原是进行疫苗研究的重点.为探究嗜水气单胞菌AS1.927株外膜蛋白(OMP)在乳酸乳球菌中的表达和检测其表达产物对小鼠的免疫保护效果,本研究将己克隆的ompA基因经BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后连接载体pNZ8048,转化乳酸乳球菌NZ9000,nisin诱导表达,并进行SDS-PAGE分析鉴定.结果显示,重组基因工程菌L.lactis[pNZ-ompA]表达的融合蛋白分子量约为36.2 kD,成熟蛋白分子量约为33.7 kD.将重组基因工程菌L.lac tis [pNZ-ompA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),用放射免疫法检测末次免疫一周后的各组小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的水平以及用间接ELISA法检测小鼠血清特异性抗体IgG,结果发现,该重组基因工程菌能显著提高sIgA的分泌(P＜0.05);同时在小鼠血清中的特异性抗体含量也显著高于对照组(P＜0.05).末次免疫两周后用100 LD50的Ah AS 1.927(3.3×105 cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为87.5％,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.该结果将为开发安全有效的口服基因工程鱼用疫苗提供一定的实验基础.     

嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP）的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究

为确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)AS1.927株外膜蛋白(OMP)的原核表达产物是否具有抗原性及其对小鼠的免疫保护力.本研究根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计1对引物,克隆出ompA全长基因1020 bp(GenBank登录号:EU309491),经Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后连接pET-30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia cDli)BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定.结果显示重组基因工程菌E.coli[pET-30a-ompA]表达的融合蛋白分子量约为40.7kD,可以被鼠抗嗜水气单胞菌外膜蛋白抗血清识别.将重组基因工程菌Ecoli[pET-30a-om-pA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus mussulus);末次免疫1周后用放射免疫分析小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平,检测结果揭示,该重组基因工程菌能提高sIgA的分泌(P<0.05);同时在小鼠血清中测出特异性抗体IgG(P<0.05).末次免疫2周后用100 LD50的Ah AS1.927(3.3×105> cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为75%,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.     

水稻1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶基因OsITL1的克隆、亚细胞定位及表达分析

磷酸肌醇代谢在生物感受胞外刺激及信号转导中起着重要的作用.1,3,4-三磷酸肌醇5/6-激酶（5/6-激酶）是磷酸肌醇代谢过程中很重要的一种酶,它具有肌醇激酶和蛋白激酶的双重功能.我们曾对拟南芥中的5/6-激酶基因AtITL1在逆境胁迫中的功能进行了研究,初步证明该基因与渗透胁迫有关（Chen et al.,2003）,本研究采用电子克隆的方法得到了水稻的5/6-激酶基因OsITL1,并对其亚细胞定位及在逆境胁迫下的表达特点进行了分析.     

利用RNAi技术研究水稻瘤矮病毒P8蛋白在病毒装配中的作用

水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)的一个成员,由介体电光叶蝉(Recilia dorsalis)和黑尾叶蝉(Nephotettix cincticeps)以持久增殖型方式传播。其基因组编码6个结构蛋白和6个非结构蛋白。已知结构蛋白P8是病毒外层衣壳的主要成分,但其在病毒侵染介体细胞过程中的功能尚未弄清。本研究利用体外合成的ds RNA诱导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,研究RGDV P8蛋白在病毒侵染电光叶蝉培养细胞中的功能。通过免疫荧光标记技术对ds P8处理后的电光叶蝉培养细胞进行RGDV侵染观察,发现ds P8处理不仅抑制了P8在细胞内的正常表达,同时也抑制了病毒在细胞内的积累。随后通过SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot分别检测病毒的ds RNA基因组和病毒蛋白水平的变化,发现ds P8处理显著降低了病毒双链RNA(double-stranded RNA,ds RNA)基因组的合成水平和病毒P8蛋白的表达量。由此推测RGDV P8蛋白参与了病毒粒体的组装过程和病毒在介体昆虫细胞内的有效增殖和侵染过程。本研究结果为利用RNAi技术控制水稻瘤矮病的传播提供了重要的理论依据。     

光对油菜胚中蛋白质和脂肪酸生物合成的影响

为探究光对油菜胚中蛋白质和脂肪酸生物合成中的影响,本研究于油菜开花后25 d(25 d)起,对油菜角果用锡箔进行遮光处理,分别收集遮光处理后3 d(28 d)和10 d(35 d)角果种子中的胚,以未遮光处理的油菜种子胚为对照。结果表明,与对照相比,经遮光处理的胚中叶绿素和蛋白质含量显著降低;脂肪酸组分发生明显变化,其中棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)和油酸(C18:1)含量显著增加,而不饱和脂肪酸中的亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)含量却大幅下降。进一步将开花后25 d油菜胚在加入电子传递抑制剂DCC培养基中进行体外培养,发现胚中不饱和脂肪酸的生物合成以及叶绿素含量均受到ATP的调节。综上,油菜胚发育过程中光照可以影响质体中氨基酸和脂肪酸的生物合成,从而调控油菜营养物的积累。本研究揭示了质体光合作用在油菜种子油脂积累过程中的作用,为今后培育高含油量、高品质油菜品种提供了理论依据。     

寒地早霜冻对水稻产量和品质影响初步研究

针对我国东北地区寒地气候条件下水稻产量和品质受早霜冻影响问题，用盆栽水稻在人工霜冻实验室进行模拟水稻霜冻害试验。初步结果是：水稻抽穗后霜冻处理时间越早，对沙妥产量影响越大，并建立了水稻受霜冻害减产预测模型；稻米品质虽然也受影响，但各指标受影响的程度不同，其中整精米率和垩白受影响程度较大；对食味品质虽有不良影响。但影响程度较小。     

灯盏花乙素(Scu)对猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)细胞热休克蛋白72(HSP72)及凋亡相关基因表达的影响

灯盏花乙素(scutellarin,Scu)具有清热解毒、扩张心脑血管、改善微循环等作用。通过观察不同浓度Scu对猪肾小管上皮细胞(pig kidney proximal tubular,LLC-PK1)热休克蛋白72(heat shock protein72,HSP72)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cellymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)表达的影响,探讨灯盏花乙素提高细胞耐热性的可能机制。将培养的LLC-PK1细胞随机分为37℃空白对照(Ⅰ组),42℃单纯热应激1 h(Ⅱ组),以及分别用不同浓度(1×10-5、1×10-6和1×10-7mol/L)Scu处理并42℃热应激1 h组(分别为Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组),提取各组细胞总RNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测HSP72、Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达量。结果显示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组LLC-PK1细胞HSP72和Bax的mRNA及蛋白表达量显著升高(P0.05),Bcl-2/Bax mRNA和蛋白比值显著降低(P0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白表达量并无显著差异(P0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅳ和Ⅴ组LLCPK1细胞HSP72 mRNA和蛋白的表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ组无显著差异(P0.05);Ⅳ组细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ和Ⅳ组并无显著差异(P0.05);Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组Bax mRNA和蛋白表达量均显著降低(P0.05);Ⅳ和Ⅴ组Bcl-2/Bax蛋白比值显著升高(P0.05)。研究结果表明,热应激条件下Scu可诱导LLC-PK1细胞HSP72表达,提高Bcl-2/Bax比值。结果提示,Scu可增强细胞的抗热休克作用。本研究丰富了体外培养细胞热应激反应的理论,为在实践中增加细胞抗热休克能力提供了理论依据。     

磷水平对内生真菌枫香拟茎点霉与水稻互作平衡的调控作用

内生真菌枫香拟茎点霉（Phomopsis liquidambaris,B3）能够与水稻建立互惠互利关系,但是两者之间的互作关系是否会受到土壤中有效磷含量的影响尚不清楚。本研究以水稻-B3共生体系为研究对象,在低磷（LP）、中磷（MP）、高磷（HP）三个磷水平中分别设置未接菌组（E-）、接菌组（E+）,共六个处理,探讨在室外盆栽试验与温室试验下,不同磷水平对植物-内生真菌互作关系的影响。室外盆栽试验表明,在低磷水平下,接种B3显著促进水稻生长,水稻产量提高7.05%;在中高磷水平下B3对水稻生长的作用减弱。为排除土壤中复杂环境的影响,设计温室试验,结果表明,在低磷水平下,与未接种处理相比,接种B3的水稻根冠比提高22.48%,磷含量增加39.98%,同时,B3显著增强叶绿素的含量以及水稻根部蔗糖、葡萄糖、果糖积累量,然而,低磷环境会限制B3在水稻根部的定殖量;在中磷和高磷水平下,B3定殖量高但对水稻的促生作用减弱。以上结果表明,在低磷水平下,B3与水稻之间是低丰度互作平衡关系,在该条件下,B3在水稻根部的定殖量低但能显著促进水稻生长;而在中高磷水平下,B3与水稻是高丰度互作平衡关系,B3...     

云南气候条件与稻米淀粉含量的关系

选用籼稻“云恢290”在云南的蒙自、开远和石屏进行地理分期播种试验，定量地研究了云南气候条件对稻米淀粉含量影响的关键因子和关键时期，建立了淀粉含量的气候生态综合模型。结果表明，直链淀粉与温度具有显著的负相关关系，与日照时数呈抛物线关系，影响的关键时期在齐穗前15d～齐穗后5d；支链淀粉与温度呈抛物线关系，关键时期在齐穗前10d～齐穗后15d，与日照时数呈正相关关系，关键时期在齐穗前15d～齐穗后5d，日照多有利于支链淀粉的增加。