大丽轮枝菌微菌核快速繁殖技术研究

[目的]筛选快速繁殖棉花黄萎病菌微菌核的适宜培养基.[方法]用6种培养基培养大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.),通过生长速率、微菌核数量、微菌核直径和微菌核萌发率4项指标筛选合适的培养基,用5株大丽轮枝菌菌株对实验结果进行验证.[结果]改良燕麦培养基形成微菌核的数量和直径均优于其他培养基;M1和BMM培养基形成微菌核的数量较多,其微菌核直径均小于半组合培养基;验证的结果与实验结果基本一致.[结论]改良燕麦、M1和BMM培养基,根据实验需要均可作为快速繁殖微菌核的理想培养基.     

pH及盐分对大丽轮枝菌微菌核形成的影响

微菌核是棉花黄萎病原大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)在土壤中的主要存活形式及该病的侵染源,研究土壤pH及盐分对大丽轮枝菌微菌核形成的影响对明确黄萎病发生具有重要意义。采用菌丝生长速率法研究培养基pH及盐分质量浓度与种类对病原菌生长及微菌核形成的影响。供试大丽轮枝菌菌丝生长最适pH为7.0,偏酸或偏碱会抑制菌丝生长,但培养基偏碱可显著促进微菌核形成。当pH为8.0时,大丽轮枝菌菌丝生长受抑制较小,同时微菌核区面积较pH为7.0时增加22.6%。盐分质量浓度影响大丽轮枝菌菌丝生长及微菌核形成。随培养基NaCl质量浓度增加,供试大丽轮枝菌生长受到抑制,菌落面积和菌丝面积均逐渐减小,但微菌核形成量却显著增加;当NaCl质量浓度为10g·L~(-1)时,微菌核区面积较无NaCl时增加40.7%。盐分种类影响供试大丽轮枝菌生长。随盐分质量浓度增加,氯化物(NaCl和KCl)和硫酸盐(Na_2SO_4和MgSO_4)均可促进大丽轮枝菌微菌核形成,而CaCl_2则显著促进菌丝生长,并在质量浓度大于7g·L~(-1)时抑制微菌核形成。在培养环境偏碱性或氯化物和硫酸盐含盐量较高时,均可促进棉花黄萎病原大丽轮枝菌微菌核形成量增加。     

大丽轮枝菌微菌核发育相关基因VdPKS的功能分析

为阐明与大丽轮枝菌微菌核发育相关的聚酮合成酶基因VdPKS的功能,在前期获得VdPKS被单拷贝T-DNA插入的微菌核发育异常突变体2H3的基础上,通过基因敲除和回补技术,经分子鉴定和表型验证,获得了2株VdPKS基因敲除突变体和3株回补突变体。研究发现野生型菌株孢子在接种到PDA培养基上培养的第6 d开始积累黑色素,而此时VdPKS基因的表达量也最高。敲除突变体虽然没有形成黑色素,却也观察到微菌核的初始结构,表明VdPKS基因不是微菌核形成的必须基因,仅参与微菌核发育后期黑色素的形成。致病力测定结果表明VdPKS基因与菌株的致病力无关。杀菌剂嘧菌酯和咯菌腈对敲除突变体菌丝生长的抑制率相对于野生型菌株和回补突变体有显著提高,表明VdPKS基因与大丽轮枝菌的抗逆性相关。     

大丽轮枝菌菌核型菌株T-DNA插入突变体库的构建及微菌核发育异常突变体的筛选

为阐明大丽轮枝菌微菌核形成发育的分子机理,利用农杆菌介导的遗传转化方法,建立了包含2 000个转化子的大丽轮枝菌菌核型菌株V08DF1的T-DNA插入突变体库,并在查氏、查氏-根或PDA培养基上培养,观察各转化子的菌落形态。从中筛选出130个菌落特征与野生型菌株V08DF1有明显差异的突变体菌株,其中14个突变体菌株为微菌核发育受阻。对这14个微菌核发育异常的突变体菌株进行T-DNA插入的PCR验证,均能扩增到潮霉素抗性基因,Southern杂交显示其中7个为单拷贝插入,5个为双拷贝插入,2个为三拷贝插入,表明T-DNA已经成功整合到这些突变株的基因组DNA中。     

大丽轮枝菌拮抗细菌枯草芽孢杆菌8-28菌株产芽孢条件优化

为提高大丽轮枝菌(Verticillium dahilae Kleb)拮抗细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)8-28菌株的芽孢形成率及芽孢数量,在摇瓶发酵基础上对影响菌株芽孢形成主要因素进行研究.通过单因素试验确定最佳碳源麦芽糊精、氮源黄豆饼粉、无机盐K2HPO4和MuSO4·H2O;采用正交试验对发酵培养基进行优化,摇瓶发酵生产芽孢的最佳条件为:麦芽糊精2.0%、黄豆饼粉2.0%、K2HPO40.05%和MnSO4·H2O0.01%、培养液初始pH值为7.0、种龄18 h、装瓶量50mL·(250mL)-1.在此优化条件下,发酵液中8-28茸株的芽孢微量迭到2.67×1 08个·mL-1.芽孢形成率迭到90%.     

地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白对油菜菌核病菌的抑制作用及防病效果

地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenif ormis)W10培养菌液和滤液对油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)具有较强的颉顽能力。经硫酸铵沉淀和透析而提取的W10抗菌蛋白显著抑制病菌生长,当蛋白浓度为100μg.mL-1时,对菌丝生长的抑制率在90%以上,菌核不能产生,处理菌核后菌核萌发推迟,明显抑制子囊孢子萌发和芽管伸长;当蛋白浓度为200μg.mL-1时,对子囊的孢子萌发和芽管伸长的抑制率分别达46.0%和65.6%。经抗菌蛋白处理后,病菌菌丝出现形态异常甚至断裂;细胞膜透性改变,电解质渗漏而电导率增加。盆栽试验表明,抗菌蛋白对油菜菌核病有明显的防治效果,当蛋白浓度为3000μg.mL-1时,防治效果达71.8%,与1000μg.mL-1的多菌灵或腐霉利相当;抗菌蛋白与多菌灵或腐霉利3¨1复配剂,当其浓度为1000μg.mL-1时,防病效果为67.9%~70.1%。因此,地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白可作为防治油菜菌核病的一种新型生物农药单用或与多菌灵和腐霉利复配使用。     

不同因素影响下棉田土壤中大丽轮枝菌微菌核的数量特征

[目的]土壤中大丽轮枝菌的微菌核是棉花黄萎病发生的关键因子,研究外界因素对土壤中微菌核数量的影响特征,为棉花黄萎病的防治提供参考意义.[方法]利用选择性分离培养与荧光定量PCR技术,检测采自新疆棉花黄萎病田内不同处理组土壤中的微菌核,并结合室内盆栽试验进行验证.[结果]大丽轮枝菌微菌核在棉田土壤中呈聚集分布,不同抗病性...     

大丽轮枝菌拮抗细菌多粘芽孢杆菌7-4菌株的筛选与鉴定

为筛选对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)具有拮抗作用的芽孢细菌,采用改良的琼脂平板扩散法,通过初筛从各地的土样中分离到84株拮抗细菌菌株,再对其进行复筛,得到1株具有较强抑菌活性的拮抗细菌7-4菌株,并对该菌株进行了形态特征观察和生理生化鉴定,初步判断其为多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)。     

棉田大丽轮枝菌微菌核的空间分布及其抽样技术

大丽轮枝菌可侵染660多中植物,由其引致的黄萎病具有危害性大、难于防治等特点。微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要存活结构和初侵染源,研究其在土壤中的分布特征及抽样技术,对于准确预测黄萎病的发生为害状况具有重要意义。土壤微菌核调查结果表明,在0~20cm土壤中,微菌核主要呈聚集或均匀分布,随密度而变化。建立的理论抽样数模型为:n=1.467 9(t/D)2 m-1.260 4。利用得到的棉田土壤大丽轮枝菌微菌核调查的序贯抽样模型计算,最多只需抽取35个样点。对各等距机械抽样方法比较后,认为实际中用双对角线取样比较合适,取样数量因土壤中微菌核的密度而异。     

5种植物提取物及残体对棉花黄萎病菌的抑制作用

【目的】研究5种植物提取物和残体对大丽轮枝菌的抑制作用,为利用生物熏蒸技术防治棉花黄萎病提供依据。【方法】以棉花黄萎病主要致病菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)XJ2008菌株为试材,测定韭菜、葱、薄荷、藿香和薰衣草5种植物的甲醇、水提取物,对大丽轮枝菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用,并将植物残体以质量分数2%添加到600g基质与田园土的混合样中混匀后,测定植物残体对大丽轮枝菌微菌核萌发的影响。【结果】5种植物提取物均对大丽轮枝菌的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用,随着植物提取物质量浓度的增加,抑制作用增强,甲醇提取物的抑菌作用略强于水提取物;韭菜提取物的抑制作用最强,藿香次之。植物残体对大丽轮枝菌微菌核的萌发有明显抑制作用,其中藿香残体的抑制作用最强,薄荷、韭菜次之,薰衣草最弱。【结论】韭菜、藿香对大丽轮枝菌的抑制作用十分明显,有作为生物熏蒸材料的潜力和应用前景。     

棉花黄萎病菌致萎毒素的初步研究

实验室培养棉花黄萎病菌,用查彼克培养基,在25℃下培养15天是病菌致萎毒素产生的适宜条件。病菌危害棉花导致棉株凋萎死亡的毒素物质主要是蛋白质,其组份多为糖蛋白,含有17种氨基酸,其中酸性氨基酸占21.2％,碱性氨基酸占8.9％,电泳分离出13条蛋白质条带。棉花品种中棉所10号和FR-1棉苗在病菌毒素稀释液内浸至65小时,病情指数分别达到70.45和47.73。     

棉花黄萎病菌的遗传变异

从棉花黄萎病病原菌的分化、变异途径（异核现象和异核体、准性生殖、细胞质变异）、研究方法（形态观测法、生物鉴定法、生理测定法、生化分析法）及应用分子生物学技术（ＲＦＬＰ技术,ＰＣＲ和ＲＡＰＤ技术）等４个方面,对国内外的研究状况进行了全面综述。     

大丽轮枝菌VdLac基因克隆与功能分析

为探讨漆酶基因VdLac在大丽轮枝菌中的功能,克隆该基因并利用农杆菌介导的遗传转化方法和PEG介导的原生质体转化方法对VdLac进行敲除和功能回复,获得敲除和互补突变体。以野生型JY为对照,对敲除突变体和互补突变体进行生物学功能测定。结果显示,VdLac基因全长1 978bp,cDNA序列全长1 713bp,编码570个氨基酸组成的蛋白质;VdLac基因缺失突变体(△VdLac)对硝化压力更敏感,其在CM培养基上仍可产生漆酶,但产生漆酶的能力降低;表明大丽轮枝菌漆酶基因VdLac不影响菌株的营养生长、产孢、致病力以及黑色素合成。     

新疆棉花黄萎病菌营养体亲和性研究

１９９６－１９９８年从新疆各主要植棉区采集３０个野生型棉花黄萎病菌菌株,陕西省植保所提供Ｔ－９、ＶＤ－８、安阳菌株及泾阳菌株,经在ＷＡＣ培养基上诱发培养,３４１个突变体,其中１１４个为ＮｉｔＭ,占２６．４５％,３１７个为Ｎｉｔｌ,占７３．５５％。经营养体亲和性配对测试,３２个菌株可分为２个营养亲合群（ＶＣＧｓ）,Ｔ－９与ＶＤ－８属于亲合群Ｉ（ＶＣＧ１）,其余３０个菌株属于亲合群Ⅱ（ＶＣＧ２）,即落     

防治植物枯、黄萎病的优良放线菌株筛选

采用平板对峙法、生长速率法和组织研磨法对实验室前期获得的放线菌进行测定,以期筛选出对植物枯、黄萎病生防作用较为全面的优良放线菌株。皿内抑菌试验结果表明,菌株SC11的抑菌能力最为突出,对3种靶标菌的平均抑制率接近80%,菌株153、SE2和F46也有较好的抑菌效果,平均抑菌率均超过50%;耐药性试验结果表明,菌株153、SC11耐药性较强,菌株F46在各杀菌剂存在条件下均不能生长;盆栽试验结果表明,菌株153、SC11在不同作物上均有较强的定殖能力,对供试作物种子萌发及植株生长有明显的促进作用。经室外盆栽模拟大田试验证明,153、SC11放线菌具有较好的防病促生效果。总体来看,菌株153和SC11的生防特性较全面,抗菌、耐药、易定殖并且能够促进作物生长,具有一定的应用潜力。     

落叶型大丽轮枝菌T-DNA插入突变体库的构建

采用ATMT技术建立大丽轮枝菌落叶型菌株XJ2008菌株的T-DNA插入突变体文库,共获得6 043个突变体。从中随机挑选104个突变体,以野生型XJ2008菌株为参照,评价其致病性、菌落生长速率、分生孢子及微菌核的产生能力等。结果表明,有12.5%的突变体丧失产孢能力,4.8%的突变体的生长速率显著减慢,8.7%的突变体的生长速率显著加快,12.5%的突变体丧失产生微菌核的能力,47.1%的突变体的致病性显著低于野生型菌株XJ2008,且突变体2-736、2-740、2-745的病情指数分别约为野生型菌株XJ2008的0.184、0.168和0.197倍。该突变体库突变体遗传稳定性好,性状多样性丰富。     

The Influence of the Verticillium dahliae Kleb Infection on the Anti-Enzyme Inside the Body of the Cotton with Different Root Injured Degree

This study was to explore the influence of the Verticillium dahliae Kleb inflection on the anti-enzyme inside the body of the cotton with a different root injured degree. When the cotton seedling was long, with four leaves, it was flushed with water carefully, and then the following were obtained: (1) complete root seedling; (2) cut root seedling - by cutting off the lower part, 3-5 cm of the root, with a disinfected knife; (3) injured root seedling - by cutting off most of the side roots, but keeping the main root. Three kinds of cotton seedlings with different roots were immersed separately in different concentrations of the germ liquid (V. dahliae) of 20 mL each. Through 0-48 h, the wilt degree of the seedling was recorded, and the related anti-enzyme of the variety was measured. After being immersed in the germ liquid, there was a significant difference in the wilt degree of the three kinds of injured root. When the germ liquid was in the ratio of 1:10, the complete root seedling was the lightest with no wilt; the injured root seedling was the second with a 2-degree wilt; but the cut root seedling was the most serious with a 3-degree wilt. At the same time, the changes in the peroxidase and malondialdehvde activities were determined.Peroxidase (POD) activities in the cut root seedling were 38.2 U mg-1 min-1, in the injured root seedling were 42.96 U mg-1 min-1, and in the complete root seedling were the highest at 49.2 U mg-1 min-1. The malondialdenvde (MDA)content in cut root seedling was 39.483 mmol g-1, injured root seedling was 27.12 mmol g-1, and the complete root seedling was only 3.845 mmol g-1. The activity of the related anti-enzymes, such as POD was high or low, the quantity of the MDA was more or less, which they met the order of the harm of the seedlings. The change of SOD activities in cut root seedling was the most obvious as well. After injuring and inflecting the young roots, the exterior pathological reaction of the seedling and the dynamic state biochemical reaction of the related enzymes inside the plant body were studied. It showed that the plant exterior pathology responded to the test, with the internal biochemical reaction fitting together mutually.