真核生物启动子TATA-box·GC-box和CAAT-box的分析

下载了已经通过试验证实的2 541条真核生物启动子序列,运用生物信息学方法分析了TATA-box、GC-box和CAAT-box的数量及其在启动子中的分布情况。结果表明,有23.85%真核生物启动子序列中至少有1个TATA-box,且TATA-box主要分布在转录起始位点前24~36 bp的区域内;有47.30%真核生物启动子序列中至少有1个GC-box,且GC-box在转录起始位点前23~128 bp的区域内分布比较集中;有42.35%真核生物启动子序列中至少有1个CAAT-box,且CAAT-box在转录起始位点前51~159 bp的区域内分布比较集中。这说明TATA-box在真核生物启动子中的位置比较固定,对基因转录的正确起始可能起着重要的作用;而GC-box和CAAT-box分布区域较广,数量也明显多于TATA-box。     

水稻HL-CMS细胞质雄性不育基因的体外转录及Northern Blot检测

[目的]通过基因克隆和体外转录技术获得水稻红莲型细胞质雄性不育(HL-CMS)不育系粤泰A(YTA)中的2个细胞质雄性不育基因orf216和orfH79的RNA,为Northern Blot检测提供阳性定量标准品,并可作为凝胶阻滞试验的底物,用于研究与恢复基因编码产物的相互作用,从而为阐释不育基因与恢复基因的相互作用分子机制奠定基础。[方法]以红莲型胞质雄性不育基因orf216和orfH79的特异引物,利用不育系YTA为材料,PCR扩增获得相应片段,分别连接至pGEM-T Easy质粒并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,补平粘性末端,以rN4为底物、用依赖于DNA的RNA聚合酶进行体外转录,转录产物用DNase处理除去DNA模板,纯化并测定RNA浓度,并用Northern Blot验证。[结果]获得了细胞质雄性不育基因orf216和orfH79各自的RNA,经检测orf216浓度为1.286μg/μl,A260/A280为2.01;orfH79浓度为1.006μg/μl,A260/A280为2.10。[结论]运用体外转录技术获得的RNA片段条带单一,纯度较高,可用于体外大量获取目的 RNA。     

徐淮山羊多能性转录因子mRNA制备及在成纤维细胞中的表达

【目的】克隆徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的CDS片段,构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒,随后构建含T7启动子的pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒,通过体外转录,获得该4种多能性转录因子的mRNA,并使其在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达。【方法】应用RT-PCR方法分别从徐淮山羊睾丸组织、皮肤组织、小肠组织中扩增多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码全序列,将该4种基因分别克隆到pMD19-T载体,构建pMD19-T-oct4、pMD19-T-sox2、pMD19-T-klf4和pMD19-T-c-myc重组质粒。然后将pcDNA3.0载体和pMD19-T重组载体双酶切后用T4连接酶连接,构建含有T7启动子的真核表达载体pcDNA3-oct4、pcDNA3-sox2、pcDNA3-klf4和pcDNA3-c-myc重组质粒。各重组质粒分别用限制性内切酶XhoI、XbaI单酶切,酶切后质粒模版按照体外转录试剂盒说明体外转录获得各多能性转录因子的mRNA,并对获得的mRNA进行检测,确定其稳定性和浓度。按照脂质体（体积）﹕mRNA（质量）为1﹕1的比例用脂质体2000转染。转染24 h后,利用Western blot技术、间接免疫荧光实验检测徐淮山羊多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的mRNA在成纤维细胞中的表达。【结果】①克隆得到的徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因编码序列全长分别为1 083、962、1 434和1 320 bp,并经TA克隆测序验证,其CDS 序列与绵羊、人、牛和猪等的序列相似性在89%以上;②体外转录获得的4种多能性转录因子的mRNA经脂质体转染徐淮山羊成纤维细胞,在成纤维细胞中均定位于细胞核;③4种多能性转录因子的mRNA在徐淮山羊成纤维细胞中表达的蛋白与预期大小一致,分别为38、34、50和48 kd。【结论】成功克隆了徐淮山羊Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因,该4种多能性转录因子的mRNA能够在徐淮山羊成纤维细胞中稳定表达,为进一步研究Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的功能和山羊体细胞的重编程奠定基础。     

牛Sry启动子调控序列的鉴定

【目的】Sry是大多数哺乳动物雄性性别发育的决定基因,但人们仍未找到其表达的调控规律,本试验对牛Sry5′端调控序列作了初步的研究,为深入研究牛Sry的表达调控奠定了基础。【方法】克隆牛Sry5′端侧翼1056bp长的DNA序列,利用生物信息学方法对这一区域内潜在的转录起始位点进行了预测,并构建了10个不同长度的缺失牛Sry5′部分侧翼序列的报告基因载体;进一步分离了胎牛生殖嵴,进行生殖嵴细胞的原代培养,并对胎牛生殖嵴细胞进行了性别和特征鉴定;最后利用荧光素酶双报告基因分析系统,在生殖嵴细胞内检测了牛Sry核心启动子区域的位置。【结果】体外培养的生殖嵴细胞可以表达雄性生殖嵴细胞的特征基因Sry、Sox9、Sf-1和Dax1,牛Sry5′端-93、-419和-722处存在3个潜在的转录起始位点(TSS),-599—-565区域35bp内存在控制Sry基础转录活性的顺式调控元件,其中存在多个潜在的转录因子结合位点。【结论】牛Sry5′端UTR区-599—-565bp区域35bp存在部分调控序列。     

植物基因启动子的克隆及分析的研究进展

植物基因的表达受到其转录因子调控。在转录因子的调控过程中,启动子的顺式作用原件与转录因子相结合发挥着重要作用。所以,对于启动子结构和功能方面的研究可为今后启动子作用机制的研究奠定基础,更为启动子在基因表达调控中的作用提供重要依据。本文综述了克隆植物启动子的常用技术方法,比较分析其优缺点,并对启动子研究方法进行总结,展望应用前景。     

高尔基体驻膜糖蛋白GP73启动子克隆

[目的]寻找并克隆有活性的高尔基体膜蛋白GP73的启动子。[方法]对GP73基因转录起始位点上游1 000 bp至下游400 bp序列进行软件分析预测,以肝癌细胞系Huh7基因组DNA为模板,扩增目标片段,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的重组质粒,转染细胞后在荧光显微镜下观察EGFP的表达,并采用流式细胞仪定量检测转染细胞的荧光强度。[结果]发现GP73转录起始位点上游980到下游330 bp长1 310 bp的序列具有启动子功能。该区域可能具有两个核心启动子序列和多个保守序列,包括TATA box和NF-κB、AP1、GC-SP1等DNA结合序列。[结论]该研究为探讨GP73的转录机制提供了参考。