猪圆环病毒2型抗体胶体金检测试纸条的研制

应用胶体金免疫层析技术,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,在玻璃纤维膜上包被胶体金标记PCV-2抗原(cap蛋白),在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被PCV-2抗原(cap蛋白)和PCV-2单抗,制成猪圆环病毒2型抗体免疫金标检测试纸条。该试纸条与猪圆环2型抗体酶联免疫检测试剂盒对比,符合率为94.7%,整个实验过程只需15 min,与ELISA试剂盒比较,具有操作方便、快速、直观的优点。     

新城疫快速诊断试纸条的研制及初步应用

以红色胶体金标记鸡新城疫(ND)抗体，兔抗鸡ND抗体和兔抗鸡二抗包被于硝酸纤维素膜上，研制出快速诊断鸡新城疫的免疫层析测试条。将试纸条插入样品中，利用滤膜的层析作用，使加在膜一端的样品，向另一端移动，在移动过程中抗原与抗体发生反应，产生肉眼可见的红色条带。该法具有操作简便、快速准确、特异性强、重复性好，无需任何仪器设备等特点，对于鸡场中快速诊断及防治本病具有重大意义。     

二种方法检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的比较

分别用血清中和试验和单克隆抗体阻断酶联免疫吸附试验对８１头美国进口猪轿清作猪传染性胃肠炎抗体检测。ＳＮ试验同７份阳性血清，检出率为８．６４％，Ｂ－ＥＬＩＳＡ试验检出７份ＰＲＣＶ抗体阳性血清，检出率为８．６４％，无ＴＧＥ阳性。ＳＮ试验检出７份ＴＧＥ抗体阳性血清与Ｂ－ＥＬＩＳＡ试验检出的７份ＰＲＣＶ抗体阳性血清完全重合。结果证明，应用单克隆抗体进行的Ｂ－ＥＬＩＳＡ可鉴别诊断ＴＧＥ与ＰＲＣＶ感染，优于Ｓ     

猪传染性胃肠炎的防制

猪传染性胃肠炎(TGE)是一种高度接触性传染的病毒性传染病,以引起2周龄以下仔猪呕吐、严重腹泻和高死亡率为特征。虽然不同年龄段的猪对这种病毒均敏感,但5周龄以上的猪死亡率很低。育成猪和育肥猪的临床症状轻微,只表现为数天厌食或腹泻。一般情况下,7天即可耐过。     

猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体的研制

针对猪传染性胃肠炎病尚无有效的治疗药物,本文研究开发抗猪传染性胃肠炎病毒卵黄抗体,以期为该病的防治提供技术支持.用猪传染性胃肠炎灭活疫苗按程序免疫90～140日龄健康商品海兰褐蛋鸡,三免14天后收集高免蛋进行卵黄抗体提取、ELISA抗体效价检测及攻毒保护试验.高免蛋三免后14天效价可达到1:256,并维持3个月,三免后...     

猪传染性胃肠炎病毒核酸免疫昆明鼠的抗体应答

以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH98株N基因的重组质粒pHN为模板，Li-15和Li-2为上、下游引物扩增出TGEVTH98／N基因。将N基因与真核表达载体pcDNA3．1( )分别用BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后连接，构建了重组真核表达载体pcDNA—N。将昆明鼠随机分为2组，分别肌肉注射pcDNA—N和pcDNA3．1( )，每只鼠100μg，共免疫3次，每次间隔2周。首次免疫后第0、14、21、28、35、39、47和54d采血分离血清，采用ELISA检测抗体动态变化。注射pcDNA—N组小鼠在首次免疫后第39d检测到针对TGEVN蛋白的阳性抗体。     

猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻二联弱毒疫苗的研究

用TGE及PED克隆化弱毒株以1：1配比制成TGE、PED二联弱毒疫苗,毒价为107.0-7.5TCID50／0.3ml,主动免疫与被动免疫的保护率为97.7％及98％。弱毒株毒力稳定,符合制苗标准。免疫期7个月,疫苗保存期一年,疫苗接种猪对同圈饲养的非免疫猪有低效价（16～32倍）的水平感染。6个猪场的田间试验保护率为95％-98％,对紧急预防接种的防制效果更为明显。     

猪传染性胃肠炎病毒的分离与鉴定

将经胶体金试纸条和RT-PCR鉴定为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性的内蒙古某猪场的粪便样品,经ST细胞分离培养后,得到一株能产生明显细胞病变的毒株。纯净性检测结果显示,该毒株无细菌生长,无支原体及无外源病毒污染。特异性检测结果表明:该分离株能被TGEV特异性阳性血清中和,且能被TGEV FA荧光抗体识别。采用TGEV N基因特异性引物,经RT-PCR可扩增出1215 bp特异性片段,将该片段测序后与GenBank中已发表的13株TGEV N基因的序列进行同源性比较,同源性为98.1%~100%,其中与我国分离的H16、JS2012以及Miller M6毒株同源性关系最近,均为100%。结果表明,分离到的毒株为TGEV,命名为TGEV NMG株。     

以乳酸杆菌为载体的猪传染性胃肠炎病毒S基因A、D抗原位点DNA疫苗的构建

应用pRc/CMV2真核质粒骨架,先后插入猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因AD抗原位点片段和乳酸杆菌复制子基因Rep.8014,构建了pRc/CMV2-SAD-Rep.8014真核表达穿梭质粒。将其转染PK-15细胞,RT-PCR检测到S基因A D抗原位点的mRNA表达。随后,将pRc/CMV2-SAD-Rep.8014质粒电转化猪源的Lactobacillus acidophilusSW1株,成功构建了以乳酸杆菌为载体的带有TGEV S基因AD抗原位点的DNA疫苗株L.acidophilusTGES-1。本研究结合了乳酸杆菌胃肠道常在共生菌的优势和TGE呈现肠道局部发病的特点,达到益生性与免疫预防的双重功效,对乳酸杆菌口服DNA疫苗进行了有益的探索。     

猪传染性胃肠炎病毒呼吸道途径侵染后在体内的动态分布

应用猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）分别对25日龄和40日龄的SPF仔猪进行气管内注射攻毒。攻毒后每24h致死1头仔猪．用免疫荧光染色检测各脏器内病毒的消长情况。并采血检测抗体。结果．在25日龄的仔猪中．仅3头出现腹泻症状。且很快耐过；剖检可见不同程度的肺部病理变化；攻毒后24h气管和肺脏样品的IFA呈阳性。抗体效价随着时间的延长而增高。40日龄仔猪临床表现和训检变化基本正常。所有的胃肠道样品的IFA均为阴性。结论：气管内注射后，TGEV可在呼吸系统中增殖．但未能在消化道系统中检出。     

猪传染性胃肠炎与流行性腹泻病毒二重RT-PCR 检测方法的建立及应用

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)与流行性腹泻病毒(PEDV)的快速鉴别诊断方法,本研究根据GenBank已登录的TGEV核蛋白(N)基因和PEDV膜蛋白(M)基因保守区域序列分别设计了1对特异性引物,以TGEV和PEDV混合总RNA为反转录模板,建立了TGEV和PEDV的二重RT-PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了应用检测,并对检测到的阳性样品进行克隆测序。结果表明,成功建立了TGEV和PEDV二重RT-PCR检测方法,该方法的检测灵敏度最低极限为10 TCID₅₀/mL病毒含量,重复性好,特异性强,可特异性地扩增TGEV和PEDV细胞培养物,但对ST细胞和其他7种病原对照扩增不出任何条带;对22份临床疑似TGEV和PEDV感染样品检测结果与测序结果完全一致。本研究成功建立了TGEV与PEDV二重RT-PCR检测方法,可适用于猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病的快速鉴别诊断。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR Green I模式实时定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

登录GenBank下载猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的N基因序列,依据保守区设计一对特异性引物,采用SYBR GreenⅠ随机结合渗入法,建立检测猪传染性胃肠炎病毒的实时定量RT-PCR检测方法,成功构建了检测TGEV的标准DNA模板,循环阈值(Ct)与标准DNA模板在1.0×10-1.0×107拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.9985。该方法用于检测TGEV具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪传染性胃肠炎病毒的快速检测。用建立的检测方法对82份临床样品进行了检测,和普通PCR检测结果100%相符。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株HP基因的克隆与序列分析

hp基因位于猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因组的3′端,该基因在病毒复制时表达编码一个78AA、9100的疏水蛋白。该蛋白可以与猪超免抗TGEV血清发生免疫沉淀反应。目前,对其功能的研究还不是十分清楚。但就其在细胞内的位置而言,hp蛋白可能对复制复合体膜的缔合以及病毒粒子的装配起重要作用。根据Genebank已发表的TGEVhp基因cDNA序列,利用Oligo4.1软件设计一对引物,进行RT-PCR扩增hp基因。将PCR产物用KpnI和XbaI酶切后克隆到载体pPROEXHTc的KpnI和XbaI多克隆位点上。然后对重组质粒进行相应的酶切鉴定和PCR鉴定。将重组子测序并且与其国外分离株进行同源性比较。结果表明,hp基因克隆成功是可信的。本研究为进一步研究TGEV的基因组及其非结构蛋白奠定了重要基础。     

猪传染性胃肠炎病毒与猪呼吸道冠状病毒荧光RT-PCR鉴别检测方法建立与应用

本研究根据Genbank登录的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因和S基因保守区序列设计合成了两对引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测TGEV的方法。该方法能有效地鉴别序列密切相关的猪传染性胃肠炎病毒与呼吸道冠状病毒。与常规RT-PCR试验比较表明,所建立的荧光RT-PCR检测技术快速、敏感,检测时限3个小时以内,具有很好的特异性和重复性。通过对39份临床样品进行检测,结果表明所建立的检测方法直接检测样品中猪传染性胃肠炎病毒。     

Prokaryotic Expression and Development of an Indirect ELISA Detection Method of Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus N Protein

In the study,the recombinant expression plasmid pET28a-TGEV-N was constructed,and expression and purification of the TGEV N protein was completed.Through SDS-PAGE and Western blotting analysis,the N protein could be identified by transmissible gastroenteritis virus (TGEV) positive serum.Using the TGEV N protein as diagnosis antigen,we established an indirect ELISA method for detecting TGEV serum antibodies.The coefficients of variation of intro-batch and inter-batch duplicability test were less than 5%.The specificity was 100%,and the rate of false positive and the false negative rate were 0 and 5%,respectively.No cross reactions with seven porcine diseases positive serum were detected.Using this method,the clinical serum samples were detected.The results showed 100% coincidence rate compared with neutralization test.The method could detect TGEV antibody quickly and effectively,and had good repeatability and specificity,which laid the foundation for the development of standardized diagnostic kits.