香石竹DcMAPK1和DcMAPK2的克隆及功能初#br# 步分析

 分离了香石竹（Dianthus caryophyllus）两个促分裂原活化蛋白质激酶（mitogen-ac-tivated protein kinase,MAPK）基因cDNA 全长,分别命名为DcMAPK1 和DcMAPK2,其中DcMAPK1 与拟南 芥AtMAPK6 高度同源。DcMAPK1 在香石竹花瓣衰老过程表达增加,乙烯处理显著促进其表达,瞬时抑 制DcMAPK1 后切花瓶插寿命显著延长。而DcMAPK2 在花瓣衰老过程中组成型表达,乙烯处理对其表达 无显著影响,瞬时抑制DcMAPK2 对切花瓶插寿命无显著影响。     

香石竹水孔蛋白基因的克隆及表达分析

以香石竹(Dianthus caryophyllus)‘马斯特’为试验材料,在分析香石竹和石竹转录组数据的基础上克隆得到10个水孔蛋白(AQP)基因,7个属于PIP亚家族,3个属于TIP亚家族;其中DcaAQP1、DcaAQP2、DcaAQP3、DcaAQP4、DcaAQP6、DcaAQP8和DcaAQP10在萼片中优势表达,DcaAQP5在茎和花瓣中优势表达,DcaAQP7在叶中优势表达,DcaAQP9在各个组织中表达均比较低;在切花开放萎蔫过程中,DcaAQP1、DcaAQP3和DcaAQP6的表达量从花蕾期开始升高,半开期达到最高,DcaAQP4、DcaAQP7、DcaAQP9和DcaAQP10在盛开期表达量达到最高;DcaAQP2在花蕾期表达量最高,DcaAQP5在开始萎蔫期表达量达到最高,表明多个AQP基因协同作用来维持切花开放萎蔫过程中花瓣细胞水分吸收和营养物质转运。     

香石竹切花水孔蛋白基因DcPIP2的克隆及特征分析

 采用RT-PCR和RACE技术从香石竹（Dianthus caryophyllus L.）叶片中获得质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）类水孔蛋白（aquaporins,AQP）基因的cDNA全长序列,命名为DcPIP2,GenBank登录号为GU989036。该cDNA全序列长983 bp,包含有858 bp的完整阅读框（ORF）,编码285个氨基酸,分子量约为30.6 kD。克隆相应的DcPIP2基因组全长序列得知,该基因长2 635 bp（GenBank登录号为JF706350?）,包含由3个外显子和2个内含子组成的编码区序列。同源性分析显示,DcPIP2氨基酸序列与陆地棉（Gossypium hirsutum）PIP2;3（ACB42440）、麻疯树（Jatropha curcas）AQP（ABM54183）和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）PIP2（ACV66986）氨基酸的同源性分别为89%、88%和87%。利用实时荧光定量PCR技术研究表明,DcPIP2基因在香石竹切花的叶片、茎颈部、花瓣、雌蕊、雄蕊和萼片中均有表达,表达量为雌蕊 > 花瓣 > 雄蕊 > 萼片 > 茎颈部 > 叶片。     

蜡梅CpAGL6基因启动子的克隆及功能初步分析

利用hiTAIL-PCR法,从蜡梅（Chimonanthus praecox）基因组中克隆到花发育相关基因CpAGL6翻译起始位点上游1 266 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子序列中存在启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。为进一步分析CpAGL6启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用农杆菌介导法转化烟草。对转基因烟草进行GUS组织化学染色及GUS酶活性定量检测,结果显示,CpAGL6基因启动子能够驱动GUS基因在转基因烟草的叶、茎、花中表达,并且在不同花期表达强度存在差异,在根中几乎不表达。转基因植株经黑暗、赤霉素和4 ℃低温处理后,GUS酶活性均有所增加。结果表明,CpAGL6启动子主要驱动GUS报告基因在花器官和绿色器官组织中表达,推测其在抵抗非生物胁迫中具有重要作用。     

黄瓜蜡质合成调控基因CsWIN1的克隆与功能初步分析

从黄瓜中同源克隆了拟南芥中具有调控蜡质合成与代谢功能的基因WIN1/SHINE1,命名为CsWIN1。荧光定量PCR结果表明:CsWIN1在黄瓜植株的叶片和幼果中高表达;通过在拟南芥中过表达CsWIN1,发现其与已报道的WIN1/SHINE1过表达株系表型相似。通过对CsWIN1转基因株系的基因表达分析发现,蜡质合成相关基因的表达受到了调控。根据以上研究结果,推测CsWIN1与拟南芥WIN1/SHINE1在表皮蜡质合成调控上的功能是保守的,通过调控下游蜡质合成相关基因的表达从而影响蜡质的合成与代谢。     

大白菜耐旱相关基因BpNFYA5 的克隆及功能初步分析

 以拟南芥（Arabidopsis thaliana）NFYA5 基因（GenBank 登录号：At1g54160）的序列为基准,通过比对获得芸薹属大白菜[Brassica campestris L. ssp. pekinensis（Lour.）Makino]同源EST 序列;采用电子克隆的方法从大白菜中克隆到相关基因全长序列,命名为BpNFYA5。该基因包含3 个内含子,其推导蛋白与拟南芥NFYA5 CCAAT-box 结合域相似性达92.6%。对大白菜进行干旱胁迫,发现BpNFYA5显著上调表达。构建了植物过表达载体pBIn-NFYA5 和RNA 干扰载体pFGC-NFYA5,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导浸花法转化拟南芥。经除草剂、潮霉素筛选及PCR 鉴定获得转基因植株。采用干旱和10% PEG6000 模拟亏水胁迫,对转基因材料的T2 代进行了耐旱性鉴定。结果显示：过表达植株（OL）较野生型植株（WT）和干扰表达植株（Ri）叶绿素含量高;渗透胁迫下OL 植株脯氨酸含量迅速积累,积累量显著高于WT 和Ri 植株;控水干旱2 周OL 株系较WT 及Ri 材料具有更好的干旱耐受性;OL 株系离体叶片的失水速率较小,叶片有效水分利用率较WT 和Ri 高。结果表明所克隆的基因BpNFYA5 在亏水胁迫调控中具有抗旱作用。     

拟南芥NCED4基因的克隆及初步功能鉴定

以拟南芥为试材,采用PCR及DNA重组技术,从野生型拟南芥中克隆出NCED4基因,并构建植物表达载体pBI-NCED4,最终获得具有卡那霉素抗性的转基因拟南芥植株,研究NCED4基因超表达对植物体的影响,并对其中4个再生植株进行PCR和荧光定量RT-PCR分析。结果表明:目的基因转入拟南芥基因组中,并在转基因拟南芥中成功过量表达;NCED4基因受外源激素的影响较为敏感,其作用可能与激素的调控有关。     

杜梨PbNHX1基因的克隆、表达分析及功能验证

【目的】克隆1个杜梨Na~+/H~+逆向转运蛋白基因PbNHX1,并对其序列特征、表达特点及功能进行研究。【方法】采用RT-PCR和PCR克隆PbNHX1的c DNA和DNA序列,利用生物信息学方法进行序列分析,定量PCR检测其在非生物胁迫下转录水平变化,酵母互补试验检测PbNHX1基因的离子转运能力。【结果】杜梨PbNHX1基因c DNA编码区长1 704 bp,对应基因组DNA序列长3 594 bp,由13个外显子和12个内含子组成,编码蛋白含567个氨基酸。系统进化树显示,PbNHX1位于液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白分支上,与杨树液泡膜型Na~+/H~+逆向转运蛋白Pt NHX1.3基因亲缘关系较近。正常生长条件下,PbNHX1在杜梨叶片中表达量高于根。施加200 mmol·L-1Na Cl、10%(φ)PEG6000或100μmol·L-1ABA后,PbNHX1在叶片中的转录水平持续上升;其在根中的表达量先升后降,表达高峰依次出现在处理后6、3和6 h。PbNHX1的转入可恢复Na Cl、KCl和潮霉素B对nhx1缺失酵母菌株AXT3的生长抑制,转基因酵母细胞中Na~+和K~+含量显著增加。【结论】PbNHX1具有植物NHXs基因家族的固有特征,对盐碱、渗透胁迫和ABA处理均存在转录响应,转入该基因能够提高酵母nhx1缺失突变体AXT3对盐胁迫的耐受能力,部分恢复其对阳离子的转运功能,从而促进Na~+、K~+积累。     

苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果基因MdMYB2(基因序列号:MDP0000823458)。MdMYB2的开放阅读框(ORF)长度为873 bp,编码含有290个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为32.92 kD,等电点为4.91。系统进化树分析显示,苹果MYB2与梨MYBL2亲缘关系最近,同源性最高。组织表达分析表明,MdMYB2在苹果的各个组织均有表达,在茎和果实中表达相对较高。MdMYB2的表达明显受盐胁迫的诱导。构建了MdMYB2的表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化得到了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥植株。抗性试验表明,过量表达MdMYB2明显提高了转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。此外,异位表达MdMYB2也能提高拟南芥对盐胁迫的抗性,以上试验结果表明MdMYB2在植物盐胁迫响应中发挥重要作用。     

菠萝AcSERK1启动子的克隆及其初步活性分析

【目的】探讨Ac SERK1启动子的活性,为进一步研究Ac SERK1转录调控的分子机制提供依据。【方法】利用hi TAIL-PCR法从菠萝基因组DNA中分离Ac SERK1启动子序列,并利用Plant Care和PLACE分析该序列的顺式作用元件。将启动子与GUS融合,农杆菌真空渗透法浸染烟草叶片后,光照处理、暗处理和0.5 mg·L~(-1)2,4-D处理36 h后利用组织化学染色法检测GUS活性。【结果】克隆了Ac SERK1上游2097bp启动子序列,命名为P_(Ac SERK1)。预测结果显示,该序列除含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子核心元件外,还含有生长素、赤霉素和茉莉酸甲酯等激素响应元件,高温和低温胁迫响应元件以及光响应元件。瞬时表达结果表明,在光和2,4-D的诱导下P_(Ac SERK1)具有启动基因表达的功能。【结论】分离获得了Ac SERK1启动子序列且该启动子在光和2,4-D诱导下能驱动GUS的表达。     

油梨PaWRI1和PaWRI2基因的克隆、序列分析及表达研究

以‘哈斯’油梨(PerseaamericanaMill.)为试材,通过RACE及RT-PCR技术分别克隆得到2个AP2/EREBP类转录因子WRI1和WRI2基因的c DNA全长,分别命名为PaWRI1(GenBank登录号:MH367865)和PaWRI2(GenBank登录号:MH367866)。其中,PaWRI1基因全长为1 396 bp,含1 155 bp开放阅读框,编码384个氨基酸;PaWRI2基因全长为1 782 bp,含1 287 bp开放阅读框,编码428个氨基酸。PaWRI1和PaWRI2基因属于AP2/EREBP类转录因子家族,其编码氨基酸序列中分别均存在2个和1个典型的AP2/ERF DNA结合位点。实时荧光定量PCR检测结果表明:在油梨果实发育过程中,果肉中PaWRI1基因的相对表达量始终快速上升,PaWRI2基因的相对表达量先少量下降,而后缓慢上升;PaWRI1基因相对表达量变化与油脂积累的变化较一致,PaWRI2基因相对表达量变化与油脂积累的变化不一致。因此,推测在油梨果实发育过程中,果肉中PaWRI1基因可能参与调控油脂积累过程。     

豆梨铵转运蛋白基因PcAMT1-1 和PcAMT1-2 的克隆与功能鉴定

 为探明豆梨（Pyrus calleryana Dcne.）铵转运蛋白基因家族成员的序列特征、生理功能和表达特点,以豆梨幼苗为材料,运用电子克隆与3′-RACE 技术获得2 个铵转运蛋白基因PcAMT1-1 和PcAMT1-2,采用酵母互补和半定量RT-PCR 方法研究它们的生理功能与表达特点。结果表明：PcAMT1-1和PcAMT1-2 开放阅读框为1 518 bp 和1 515 bp,编码的蛋白分别含505 和504 个氨基酸残基。PcAMT1-1和PcAMT1-2 分别与甜橙 × 枳后代CpAMT（ABI52423）和茶CsAMT1;2（AB114913）的同源性最高（81.96%和78.31%）。PcAMT1-1 和PcAMT1-2 转入酵母均能使铵转运体缺失突变菌株31019b 恢复NH₄⁺吸收能力,在酸性条件下（pH 4.8 或5.8）PcAMT1-1 和PcAMT1-2 对31019b 的互补效果均优于中性条件（pH 6.8）。NH₄⁺有毒类似物MeA+可以显著抑制转PcAMT1-1 酵母31019b 的生长,该物质对转PcAMT1-2酵母31019b 无抑制效果;谷氨酰胺合成酶抑制剂MSX 可有效抑制PcAMT1-2 对酵母31019b 的互补效果,对PcAMT1-1 的互补效果无显著影响。正常供铵,PcAMT1-1 主要在叶中表达,PcAMT1-2 主要在根中表达;无氮处理后,PcAMT1-1 和PcAMT1-2 在根中的表达先上调后下降;重新供铵后,它们的表达量恢复;地上部的表达对上述处理无显著响应。综上所述,PcAMT1-1 和PcAMT1-2 在豆梨中具有吸收或转运NH₄⁺的功能,并可能具备不同的调控机制。     

全国各地香石竹切花价格波动及分析

依据中国花卉园艺自2001～2017年公布的全国各地鲜切花(单枝)市场历史价格,统筹北京、上海、广州、昆明、郑州、沈阳的香石竹切花价格,旨在分析各地香石竹切花价格波动特点,并寻找出影响价格波动的关键性因素,为市场价格预判提供基础。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

据《园艺学报》2014年第2期《草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析》（作者张勇等）报道，以“丰香”草莓为试材进行基因克隆，并通过SON—PCR结合RT—PCR技术检测了该基因在低温胁迫和其他环境胁迫下的诱导表达特性。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

苹果MdLsi1基因的克隆及生物信息学分析

以"秦冠"苹果叶片为试材,采用RT-PCR技术,克隆了苹果硅转运蛋白基因MdLsi1,并应用生物信息学分析其特征,以期为进一步深入研究硅促进苹果植株生长的分子机制提供参考依据。结果表明:MdLsi1基因全长873 bp,编码290个氨基酸,相对分子量为30.456 kDa。MdLsi1蛋白包含已知硅转运蛋白所具有的特征结构,6个跨膜结构域,2个天冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸序列(Asn-Pro-Ala,NPA模体),1个由甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-精氨酸(GRGS)组成的ar/R选择性过滤器,并且2个NPA模体之间间隔108个氨基酸。MdLsi1基因起始编码位点前1 500 bp序列中除了包含有基本的基因启动子元件外,还含有与多种逆境胁迫相关的顺式调控元件。以上结果提示MdLsi1在苹果植株硅的积累及植株抵御逆境胁迫中发挥重要功能。     

苹果乙烯信号转导相关基因MdEIL1的克隆及功能鉴定

以苹果‘嘎拉’（Malus × domestic‘Royal Gala’）为试材,分离了乙烯信号转导相关的MdEIL1基因（基因序列号：MDP0000423881）。序列分析表明,该基因包含长为1 980 bp完整的开放阅读框,编码658个氨基酸的蛋白。进化树分析表明MdEIL1属于EIN3/EIL转录因子家族蛋白。定量分析显示,MdEIL1基因在苹果的根、茎、叶、花和果实中有不同程度的表达,而且它的表达也受到乙烯、生长素和细胞分裂素的诱导。通过原核表达试验体外诱导MdEIL1蛋白成功,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。MdEIL1基因在拟南芥中异位表达,增强其乙烯响应,在暗处表现为下胚轴变短,并且AtERF1的表达量上升,显示转基因植株对乙烯的敏感性提高。     

南瓜肌醇单磷酸酶基因CmIMP1和CmIMP2的克隆与表达分析

以中国南瓜（Cucurbita moschata）为试验材料,利用同源克隆和南瓜转录组unigene序列获得2个IMP基因的全长cDNA序列,将两个基因命名为CmIMP1和CmIMP2,GenBank登录号为KP735607和KP735608。CmIMP1基因cDNA全长1 053 bp,包含1个810 bp的ORF,共编码269个氨基酸;CmIMP2基因cDNA全长945 bp,包含1个807 bp的ORF,共编码268个氨基酸。序列分析发现两个基因均含有磷酸酶家族锂敏感的3个特殊结构域,系统进化树分析表明这2个南瓜CmIMP与其他植物IMP有较高同源性（63.8% ~ 94.0%）,并与葫芦科作物最接近。采用荧光定量PCR研究CmIMP在各组织及逆境条件下的表达模式显示,其表达具有组织特异性,在叶中表达最高,须和幼果次之;盐胁迫和干旱胁迫可强烈诱导CmIMP表达,ABA对CmIMP的诱导较微弱,推测CmIMP在南瓜响应非生物胁迫的分子调控机制方面发挥重要作用。     

卷丹LlAGO1基因的克隆及表达分析

以卷丹（Lilium lancifolium）叶腋组织为研究材料,利用RT-PCR和RACE技术克隆得到AGO1基因的cDNA全长,命名为LlAGO1。其全长4 014 bp,开放阅读框长3 687 bp,编码1 228个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为135.36 kD,理论等电点（pI）为9.57。氨基酸序列分析表明LlAGO1含有PAZ和Piwi两个AGO1典型的结构域;信号肽预测结果表明LlAGO1蛋白不存在信号肽,为非分泌蛋白;亚细胞定位预测其主要定位于细胞核;与相关同源蛋白高度相似,且与芦笋AGO1a蛋白（XP_020260210.1）亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明：LlAGO1在卷丹叶腋、鳞片、根、叶等不同组织均有表达,其中在叶腋中的表达量最高,叶片和根中的表达较弱;腋生珠芽形成过程中,LlAGO1仅在可形成珠芽的上部叶腋表达,且在珠芽形成时表达量最高,而在不形成珠芽的下部叶腋几乎不表达,推测LlAGO1可能与卷丹珠芽的形成相关。     

芥蓝八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2的克隆与表达分析

以白花芥蓝为材料,采用反转录PCR技术克隆得到2个八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2,GenBank登录号为KX426039和KX426040,其开放阅读框分别为1 692和1 698 bp,分别编码563和565个氨基酸。同源性及进化树构建结果表明PDS蛋白在进化过程中比较保守,芥蓝PDS基因与甘蓝、白菜、花椰菜等十字花科蔬菜亲缘关系较近。半定量PCR分析发现,BaPDS1和BaPDS2表达水平在芥蓝不同发育时期和组织器官间均存在显著差异。萌动种子期BaPDSs表达量较低,之后迅速上升;BaPDS1在成熟期器官间呈现组成型表达,BaPDS2在器官间表达差异较大,幼果中未检出;花器官中萼片的BaPDSs表达量显著低于其他组织,在开花过程中,雄蕊和雌蕊的BaPDS1表达水平出现上调。