狂犬病病毒SRV_9株修饰全长基因组cDNA克隆的构建

为获得狂犬病病毒(rabies virus,RV)SRV9株的基因组全长cDNA克隆并对其进行基因修饰,深入研究狂犬病病毒的基因组特性及构建新型病毒载体,本研究根据GenBank中公布的SRV9基因组序列设计数对引物,以SRV9病毒为材料,从病毒总RNA中将全长基因组11 928 bp分5段扩增,克隆至载体测序鉴定。测序正确后,设计引物缺失基因组Ψ区并在缺失位置插入人细胞色素C基因,又设计引物删除糖蛋白(G)胞质区(CD区)。利用引物在病毒基因组起始处添加锤头状核酶序列,在病毒序列结尾处添加了丁型肝炎核酶序列。再次测序后克隆至pcDNA3.1(+)载体,利用扩增片段自身内切酶位点顺次进行修饰后全长连接,从而获得含修饰SRV9全长基因组的质粒pcDNA3.1-SRV9,为RV感染性克隆的建立奠定了基础。     

鉴别伪狂犬病病毒强、弱毒株单克隆抗体的制备

用纯化的猪伪狂犬病病毒闽A株(PRV—FA)免疫Balb／c鼠，取脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经间接ELISA筛选，获得11株能稳定分泌伪狂犬病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中6株仅与强毒FA反应，而不与弱毒FB、Bartha及gE缺失疫苗株发生反应。特异性鉴定结果表明，各株单抗均不与猪瘟病毒、猪流感病毒、猪呼吸繁殖障碍综合症病毒、猪细小病毒等发生交叉反应。     

狂犬病病毒SRV9株N、P、G和L蛋白基因的克隆及表达载体构建

以狂犬病病毒RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆获取N、P、G及L蛋白编码基因核苷酸序列,应用定向克隆技术,构建真核表达载体 pcDNA3.1-N、pcDNA3.1-P、pcDNA3.1-G及pcDNA3.1-L.经测序鉴定证实获取的N、P、G及L蛋白区全长核苷酸序列与文献报道的一致,并成功构建了其真核表达载体.     

狂犬病病毒SRV9株磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因重组质粒的构建

[目的]重组狂犬病病毒SRV9株磷酸化蛋白的P基因和基质蛋白的M基因,为构建狂犬病毒(SRV9)全长cDNA提供技术支撑.[方法]设计重组PCR引物,分别扩增SRV9的P基因和M基因,构建重组质粒pMD18-PM,并对重组质粒进行酶切、测序鉴定.[结果]PCR扩增的SRV9的P基因和M基因大小分别为893 bp和608 bp,与GenBank已发表的狂犬病病毒SRV9(登录号:AF499686)序列比较,同源性分别为99.66;和99.67;.融合基因PM片段大小为l 501 bp,与预期大小相同,且融合完全.[结论]应用重组PCR成功融合狂犬病病毒SRV9磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因,为后续构建病毒全长cDNA及感染性克隆奠定基础.     

狂犬病病毒G蛋白昆虫细胞表达及其生物信息学分析

利用RT-PCR方法从SRV9株细胞毒基因组RNA扩增G蛋白基因,然后将其克隆到p MD18-T载体上,将得到的重组克隆质粒SRV9G-p MD18T进行PCR和测序鉴定。结果表明:克隆的基因全长为1 609 bp,阅读框正确;将此SRV9株G基因亚克隆到供体质粒p Fast Bac Dual后获得了重组供体质粒SRV9G-p Fast Bac Dual;进而将重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,经2次抗性、蓝白斑筛选及PCR分析后,获得重组穿梭质粒SRV9G-Bacmid;将其转染Sf9细胞48 h后,通过细胞形态学和重组杆状病毒负染电镜观察显示,杆状病毒转染成功;通过Western blot检测显示,Sf9细胞成功表达了SRV9 G蛋白。随后,利用Ex PASy服务器上的在线分析工具和生物信息学分析软件DNAStar对G蛋白的基本性质进行了分析。试验采用昆虫细胞Bac-toBac杆状病毒表达系统,成功表达出G蛋白,并对其进行了生物信息学分析,为蛋白纯化及狂犬病诊断试剂盒的进一步研制奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究

【目的】为研制针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的疫苗提供候选毒株。【方法】构建针对猪伪狂犬病病毒流行毒株的gE/gI缺失重组转移质粒pMD-LA-RA及携带EGFP标记基因的重组转移质粒pMD-LA-EGFP-RA,将pMDLA-EGFP-RA与伪狂犬病病毒流行毒株PRV AH进行同源重组,利用EGFP为筛选标记,获得携带EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–/EGFP~+,以此毒株与pMD-LA-RA进行第2次同源重组,筛选去除EGFP基因的gE/gI基因缺失突变株PRV AH gE~–/gI~–,并通过生长曲线、易感细胞连续传代和动物免疫评价其增殖能力、遗传稳定性及免疫原性。【结果】通过2次同源重组,结合荧光观察、空斑纯化和PCR检测,成功获得了PRV AH gE~–/gI~–,经PCR鉴定、荧光观察及测序鉴定,证实该毒株g E和g I基因被成功缺失,且不携带EGFP标记基因。生物学特性研究结果表明,该毒株增殖能力与亲本毒株相当,遗传稳定性及免疫原性良好。【结论】采用同源重组技术成功构建了免疫原性良好的猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI基因缺失突变株,为研制针对流行毒株的基因缺失疫苗奠定了一定的基础。     

狂犬病病毒Flury株(LEP)在乳鼠脑内及BHK-21细胞上的传代固定及生物学特性测定

将狂犬病病毒Flury株(LEP)通过乳鼠脑和BHK-21细胞系交叉传代10代,并对交叉传代获得的各代毒种进行对细胞的适应性、病毒含量、毒力的测定。结果表明:病毒经乳鼠脑内传代后,能很好的在BHK-21细胞上增殖,各代次病毒含量均在10-6.0TCID50/0.1 mL以上,平均达到10-6.75TCID50/0.1 mL;对3～5日龄乳鼠平均LD50达到10-5.5/0.03 mL,对11～13g小鼠平均LD50达到10-4.6/0.03 mL;毒力试验证明,交叉传代的细胞毒对犬和家兔无致病性。     

配合力与杂种F1及亲本间关系的研究

以不完全双列杂交随机区组试验为基础,从统计角度论证了配合力与杂种F₁和亲本间以及配合力间的数量关系:(1)总配合力0与杂种F₁间相关系数等于1;(2)一般配合力与亲本间的相关系数等于1.特殊配合力与亲本间的相关系数等于0;(3)一般配合力间及其与特殊配合力间的相关系数等干0;(4)导出了4种配合力(和)与杂种F₁间的相关系数的简便计算公式以及配合力决定杂种F₁的3个基本性质;(4)杂种F₁与配合力的线性回归关系式为:杂种F₁=…+配合力.     

狂犬病病毒糖/核融合基因原核表达克隆质粒的构建与分析

试验将编码狂犬病病毒的糖蛋白和核蛋白基因经PCR扩增后,通过限制性核酸内切酶风PstⅠ的酶切并以T4 DNA连接酶进行连接。将所获得的基因片断与pMD-18T载体连接。经转化到大肠杆菌JM109和质粒大量制备后,进行酶切和测序鉴定。结果表明：PCR扩增片段与文献报道的狂犬病糖蛋白和核蛋白核酸序列没有差异,所构建的克隆质粒正确,新构建的融合基因没有出现新的抗原位点。     

crp缺失对猪霍乱沙门氏菌强弱毒株毒力的影响

猪霍乱沙门氏菌C500株是用化学方法将强毒株C78-1致弱,用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株,虽具有较好的免疫原性,但仍有一定的残余毒力。SC-1是临床分离的猪霍乱沙门氏菌强毒株。为了研制更加安全的弱毒株,利用重组自杀性质粒通过接合转移的方法构建了猪霍乱沙门氏菌C500株、C78-1及SC-1的crp缺失株。C78-1、crp-C78-1、SC-1、crp-SC-1、C500、crp-C500 6个毒株经小鼠毒力试验检测。LD50结果显示,crp缺失对猪霍乱沙门氏菌的毒力影响不大,毒力只是略为降低,其中以crp-C500株毒力最弱。综上所述,可以选用crp-C500株毒株作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的选择。     

猪伪狂犬病进口与国产gE基因缺失活疫苗免疫效果的比较

[目的]了解猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的免疫效果,同时制定合理的免疫程序。[方法]选用国产和进口2种猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗,采用2种不同的免疫程序进行了免疫对比试验。[结果]无论是用国产的还是进口的猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫,试验猪10、20、30、40、50、60、70日龄猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值各组间差异均不显著(P>0.05);80日龄,实行3次免疫的试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值显著高于2次免疫的试验猪(P<0.05);90、100、115日龄,实行3次免疫的试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值极显著高于2次免疫的试验猪(P<0.01)。整个试验期,通过对国产和进口猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫效果的对比,发现试验猪伪狂犬病病毒gB抗体S/N平均值各组间差异均不显著(P>0.05)。[结论]该免疫试验结果可为猪伪狂犬病免疫防控程序的应用提供依据。     

禽流感病毒 HA 基因在狂犬病毒中的表达

为了研究狂犬病毒作为载体表达外源基因的特性,将禽流感病毒 HA 基因插入狂犬病毒全基因组cDNA感染性克隆pHEP-3.0 G基因与L基因的假基因位点,再通过反向遗传技术,获得了携带流感病毒 HA 基因的嵌合狂犬病毒(HepFHA),并进行了病毒传代与 HA 基因表达的研究. 结果显示,重组病毒经BHK-21细胞传代10次,病毒表达稳定,但各代次常规红细胞凝集试验均为阴性; Western blotting检测到病毒表达产物中存在部分HA蛋白的表达,其相对分子质量为39 540,与HA裂解的HA1蛋白相对分子质量相吻合.     

黄牛狂犬病病毒的分离和鉴定

应用鼠脑传代,从具有神经症状的病牛脑组织中分离获得5株病毒,经电子显微镜观察呈典型弹状病毒样粒子.用抗狂犬病毒CVS(狂犬病毒Ⅰ型代表株)免疫血清作ELISA检测及小鼠中和试验,证明分离株病毒为狂犬病毒.用狂犬病相关病毒Lagos bat(狂犬病毒2型)、Mokola(狂犬病毒3型)和Duvenhage(狂犬病毒4型)免疫血清对分离株病毒作交叉中和试验,结果发现分离株病毒与Duvenhage有较密切的抗原联系.而与Lagos bat及Mokola病毒没有抗原联系.用自制狂犬病毒“核蛋白”单克隆抗体作夹心间接ELISA检测分离株病毒的感染鼠脑均呈阳性反应,5株病毒与CVS及其互相之间没有明显差异.结论认为,由河南省黄牛分离的病毒为狂犬病毒.     

狂犬病病毒免疫组织化学定位方法的建立

应用抗狂犬病病毒的特异性抗体及免疫组织化学方法检测接种了狂犬病病毒SRV-9毒株感染的小鼠脑组织,并对狂犬病病毒抗原进行了组织定位分析。结果表明:在小鼠的小脑分子层蒲肯野氏细胞胞浆出现明显的局灶型阳性颗粒。说明免疫组织化学方法检测狂犬病病毒敏感度高、直观,可作为诊断狂犬病病毒的辅助性方法,对研究狂犬病病毒在脑组织神经细胞及其他组织器官内的分布具有一定的意义。     

瓜枝孢弱致病菌的筛选与遗传稳定性研究

以瓜枝孢(Cladosporium cucumernium)强致病菌株为出发菌株,采用适宜高温诱变处理,筛选得到1株弱致病株,鉴定发现该菌株具有较高的诱导抗病性。把该菌株在培养基中连续培养15代,弱致病菌的遗传性状非常稳定。在寄主上进一步研究表明,该菌株也具有一定的遗传稳定性。