螺旋毛壳ND35抗生素的产生及其在病害生物防治中的作用

内生菌螺旋毛壳Chaetomium spirale ND35是一株广谱拮抗性生防因子。为了阐明菌株ND35抗生素在植物病害生物防治中的作用机制,系统研究了抗生素的产生、提取纯化及其在离体和温室条件下的抑菌防病作用。菌株ND35的发酵液经乙酸乙酯萃取,浓缩得黄褐色抗生素粗提液。平皿抑菌试验表明,抗生素粗提液对20余种植物病原真菌有抑制作用,浓度为400μg/mL时对病菌菌丝生长的抑制率范围从14．4%到72．6%。浓度为500μg/mL和1000μg/mL的抗生素粗提液对新月弯孢分生孢子萌发的抑制率分别是54．2%和75．9%。发酵时间也影响抗生素的产量,马铃著葡萄糖液体培养基中发酵15天时,抗生素产量最高。经薄层层析和高效液相色谱检测,证明有两个活性组分。温室试验表明,该抗生素粗提液稀释50倍液对玉米弯孢叶斑病的防治效果可达85．5%,稀释250倍液防治效果达63。3%。试验结果表明,抗生素是菌株ND35重要的生防决定因子之一,抗生素粗提液也展示了对玉米弯孢叶斑病具有较好的生防潜能。     

玉米纹枯病菌全长cDNA文库的构建与鉴定

 以玉米纹枯病菌菌丝为材料,利用In-Fusion SMARTer^TM cDNA Lib Construction Kit构建玉米纹枯病菌全长cDNA文库。文库质量鉴定结果表明,文库滴度为1.2×10⁶pfu·mL^-1,重组率为99.2%,插入片段平均长度大于1.0 kb。随机挑取400个白色克隆进行测序,共获得329个高质量EST序列,经聚类拼接后得到250条unique EST,包括36条contigs和214条singletons。在GenBank 进行Blastn 与Blastx 同源比对,有227条EST 与已知核酸或蛋白有不同程度的同源性,占全部EST 的90.8%,其余23条无任何同源性,占9.2%。     

云杉内生优势毛壳菌的筛选及其生防机制研究

通过形态学和分子生物学鉴定方法,将从云杉针叶中分离得到的10株毛壳菌Chaetomium鉴定为球毛壳C.globosum、粪生毛壳C.funicola、印度毛壳C.indicum和近缘毛壳C.subaffine。通过平板生长筛选和拮抗性复筛,筛选出2株生长势高且对9种常见林木病害病原拮抗性好的优势生防菌株,分别为粪生毛壳菌株C-45和近缘毛壳菌株C-44。为了进一步了解2株优势毛壳菌的生防潜力和作用机制,对其进行了包括营养竞争、重寄生、胞外酶及代谢产物等生防机制的研究。结果显示,菌株C-45和C-44对病原菌的抑制是多种生防机制的协同作用。根据2株优势菌株在不同生防机制上表现出的差异,菌株C-44的生防作用强于菌株C-45,具有很好的生防潜力。     

两株毛壳菌对马铃薯干腐病病原菌的抑制作用

为研究毛壳菌及其发酵液对马铃薯干腐病的抑制作用,选取两株毛壳菌与病原菌进行皿内对峙试验,测定毛壳菌对病原菌的抑制率,并调查菌株发酵液对病原菌孢子萌发的抑制效果及离体抑菌效果.结果 显示,在皿内对峙试验中,球毛壳菌(Chaetomium globosum)菌株22-10和粪生毛壳菌(C.funicola)菌株39-6-2...     

一株粪生毛壳菌的分离鉴定及其对辣椒枯萎病的防治效果

本文采用平板对峙法和抑菌圈法从76株粪生真菌中筛选出1株辣椒枯萎病生防菌株LJ-S2L1,并利用菌落直径法、纸片扩散法、室内毒力测定和盆栽试验评价了其防病效果。结果表明,菌株LJ-S2L1对辣椒枯萎病菌抑菌率达71.67%,可使辣椒枯萎病菌菌丝发生隘缩或断裂,抑菌圈直径达32 mm;菌株LJ-S2L1发酵液和无菌发酵滤液均对辣椒枯萎病菌菌丝生长有抑制作用,抑制率分别达61.57%和56.48%。毒力测定结果表明,菌株LJ-S2L1发酵液对辣椒枯萎病菌的抑制率在1000μL/m L时达到72.10%,抑制中浓度为300.63μL/m L;盆栽试验防治效果达到71.8%。根据形态学特征结合其分子系统发育树分析,将菌株LJ-S2L1鉴定为球毛壳菌Chaetomium globosum。     

内生菌螺旋毛壳抗生素和水解酶的协同抗真菌作用

 生防因子螺旋毛壳(Chaetomium spirale) ND35生长于含立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)菌丝细胞壁制备物的SM培养基中,从培养滤液提取的粗酶液强烈抑制Valsa sordida、Valsa mali、Glomerella cingulata和Curvulavia lunata病原真菌的菌丝生长和孢子萌发。经DNS法检测,粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶(包括内切和外切酶)和几丁质酶活性,分别为0.19 U.mg-1和0.09 U.mg-1。生长于3%玉米粉浸渍液的螺旋毛壳ND35的培养滤液也能抑制上述病原菌的菌丝生长和孢子萌发。离体条件下检测了ND35产生的一纯化的具有分子量为73 kD的内切β-1,3-葡聚糖酶(GLUC73)和一纯化的抗生素对苹果炭疽病菌的分生孢子萌发和芽管延长的抑制效果。当内切β-1,3-葡聚糖酶使用浓度为180 μg·mL^-1时,抑制了测试真菌的孢子萌发,造成细胞壁的改变,导致了菌丝顶端的破裂;抗生素的有效抑菌中浓度ED₅₀为1.75 μg·mL^-1。单独应用时,1.0 μg·mL^-1的抗生素或40 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶没有或仅有很低的抑菌效果;两者组合导致孢子萌发约78%受抑制。甚至10 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶也使1.5 μg·mL^-1抗生素的抑菌作用从低于25%增加到超过50%的抑菌效果。此外,80 μg·mL^-1的内切β-1,3-葡聚糖酶使1.0 μg·mL^-1抗生素的抑菌活性从0%提高到90%。抗生素和β-1,3-葡聚糖酶的协同抗菌活性可能在内生菌螺旋毛壳的植病生防中起重要作用。     

拮抗真菌HTC的鉴定及其对辣椒疫病的生物防治潜力

为明确拮抗真菌HTC对辣椒疫霉Phytophthora capsici的拮抗机制,采用平板对峙、形态学鉴定和18S rDNA序列比对分析等方法对菌株HTC进行了鉴定,并研究其发酵液与抗生物质粗提液对辣椒疫霉不同发育阶段的影响。经鉴定,菌株HTC为金色毛壳菌Chaetomium aureum。在平皿对峙试验中,菌株HTC的红色分泌物能抑制辣椒疫霉菌丝的生长,抑制率为59.1%,后期HTC菌丝可缠绕并降解辣椒疫霉菌丝。发酵液与抗生物质粗提液对辣椒疫霉不同发育阶段均有抑制作用,发酵液对辣椒疫霉菌丝生长的抑制率高达97.58%,对辣椒疫病的防治效果均高于70%。浇灌发酵液后,可提高辣椒苗的苯丙氨酸解氨酶、过氧化物酶、多酚氧化酶的活性,并明显促进辣椒苗生长,鲜重和干重增加32.27%和18.09%。研究表明,金色毛壳菌菌株HTC是一株具有开发潜力的生防菌株。     

蝉拟青霉侵染小菜蛾幼虫SSH文库的构建及免疫相关基因分析

为探讨小菜蛾Plutella xylostella对病原真菌入侵的免疫防御机制,利用抑制消减杂交技术构建蝉拟青霉Paecilomyces cicadae侵染的小菜蛾幼虫的抑制性差减文库,并对文库进行鉴定。ESTs序列聚类分析共获得412个独立基因。通过同源比对,28.24%ESTs为未知功能基因,71.76%ESTs与已知功能基因序列相似,包括免疫相关、金属离子结合和加工、核酸和蛋白代谢及加工、细胞信号、细胞结构、形状和流动、能量代谢、胁迫和解毒以及其它基因。鉴定出39个可能参与小菜蛾免疫蝉拟青霉侵染的免疫基因,包括：识别分子、蛋白酶及蛋白酶抑制剂、效应因子及其它免疫基因。qRT-PCR结果表明肽聚糖识别蛋白、器官芽生长因子、葛佬素、溶菌酶、酚氧化酶原激活蛋白酶3以及转铁蛋白基因均可诱导表达。免疫相关基因在不同微生物诱导下的表达模式存在不同。结果表明当病原真菌蝉拟青霉侵染寄主小菜蛾后,小菜蛾体内发生了一系列的复杂反应,小菜蛾抵御病原真菌侵染是一个多途径共同作用的复杂过程。该研究为进一步研究小菜蛾抵御病原真菌入侵的分子机制提供基础信息。     

柑橘黄龙病侵染相关抗病基因同源序列的克隆鉴定与表达分析

[目的]从黄龙病耐病寄主植物cDNA中筛选抗病基因相关序列并对其进行表达分析研究。[方法]根据已克隆的植物抗性基因表达产物NBS-LRR保守区域设计简并引物,以耐HLB的柑橘属柚cDNA为模板扩增RGAs,并进行实时荧光定量PCR。[结果]通过RFLP分析及克隆测序共得到5个NBS类抗病基因相似序列(RGAs)片段,在GenBank上登录号为HM777043～HM777047。通过Clustalx、DNAMAN等软件分析5个RGAs及其推导的氨基酸的相似性,结果显示它们均含有典型NBS-LRR类抗性基因所具有的保守区域:P-loop、Kinase-2a、GL-PLAL,其与已克隆的烟草N、亚麻L6、拟南芥RPS2、RPS5、RPP8、RPM1等抗病基因在保守区域氨基酸水平上的相似性为19.71%～42.86%。根据得到的序列设计特异性引物,对5个RGAs在HLB侵染过程中的表达进行定量PCR,结果显示嫁接病芽接穗后的8次连续采样中5个RGA的表达受到不同程度的调控。[结论]表明5个RGAs可能与黄龙病的侵染有关。     

螺旋毛壳ND35 β-1,3-葡聚糖酶的诱导、性质及其抑菌作用

 以病原菌Rhizoctonia solani的细胞壁为诱导物,模拟毛壳菌自然的重寄生过程,研究了内生真菌螺旋毛壳(Chaetomium spirale) ND35 β-1,3-葡聚糖酶的产酶条件、性质,尤其是不同碳源的调控作用。结果表明,不同种类的真菌细胞壁及几丁质和昆布多糖,均可诱导产生β-1,3-葡聚糖酶,而作为分解代谢产物的葡萄糖则抑制产酶。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Phenyl-Sepharose疏水层析,并通过SDS-PAGE鉴定,纯化了一种分子量约为73 kDa的内切β-1,3-葡聚糖酶GLUC73。其最适反应温度为55℃,在40℃以下较稳定;最适pH值为5.5,在pH 5-9范围内均很稳定;酶活性受Hg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mg²⁺等金属离子不同程度的抑制,Mn²⁺和Co²⁺对酶有激活作用;以昆布多糖为底物时,该酶的米氏常数K_m为0.412 mg·mL^-1,最大反直速度V_max为3.876 U·mL^-1。粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性,离体抑菌试验表明,对苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用。通过对β-1,3-葡聚糖进行免疫细胞化学标记和超微结构观察,间接证明了β-1,3-葡聚糖酶在螺旋毛壳重寄生过程中的作用。     

辣椒内生细菌的分离及拮抗菌的筛选

对健康辣椒植株体内的内生细菌及拮抗菌进行了分离筛选。结果表明 ,不同品种、部位及种植地 ,内生细菌的数量有所不同 ,品种间内生细菌的数量变化为 2 83× 1 0 3 ～ 1 346×1 0 4cfu/g(FW) ;各品种以叶片中内生细菌的数量最多 ,其次为根 ,再次为茎 ,果最少 ;不同种植地中 ,前作为水稻田种植辣椒叶片中内生细菌的数量比旱地种植的多 ,而根、茎、果中内生细菌的数量正相反。拮抗、防病测定表明 ,1 0 8株辣椒内生细菌中 ,有 2 8 7%的菌株对香蕉枯萎菌和黄瓜枯萎菌有拮抗作用 ;来自辣椒叶片和茎杆内的BS 2和BS 1两菌株 ,对 1 3种植物病原真菌有较强和稳定的拮抗作用 ,其中对辣椒炭疽病有 57 34%～ 94 0 8%的防病效果 ,并可以在辣椒体内定殖。经鉴定该两菌株为枯草芽孢杆菌。     

基于EF-1a序列特征的西藏毛壳属真菌系统进化分析

为研究EF-1a基因在毛壳菌(Chaetomium Kunze)属内种间的鉴别能力,采用23株毛壳菌进行EF-1a基因序列分析。通过碱基变异结果分析可发现23株毛壳菌的EF-1a基因体现出较大的变异性,通过邻近法构建EF-1a基因的系统发育树,23株毛壳菌被划分在8个分枝上,分别归属于7个不同的种。EF-1a基因不仅可以用来区分毛壳菌属的一些形态差异较大的种,如粪生毛壳(C.funicola),大果毛壳(C.megalocarpum)、球毛壳(C.globosum)和马德拉斯毛壳(C.madrasense),还可以用来区分一些形态上非常相似的种,如:印度毛壳(C.indicum)、粪生毛壳(C.funicola)和(C.erectum)、球毛壳(C.globosum)和近缘毛壳(C.subaffine)类群。同时,对一些通过形态特征不能确定的种也可以进行初步鉴定。因此,EF-1a基因可用于毛壳菌属内不同种的鉴定。     

木霉几丁质酶及其基因的研究进展

现已报道8种木霉的39个几丁质酶基因,其中22个为42kD内切酶基因.这些42kD内切酶基因的核苷酸序列及其编码的前体蛋白的氨基酸序列极为相似.42kD几丁质酶基因开放阅读框一般有3个内含子,前体蛋白一般有约22AA的信号序列,引导输出.成熟蛋白具有催化域、磷酸化域和耱基化域.基因的表达是诱导型的,受几丁质及真菌几丁质细胞壁的强诱导,受代谢物阻遏.转入植物的木霉几丁质酶基因可正确表达.本文就木霉生防菌株几丁质酶及其基因克隆、几丁质酶基因结构和功能、几丁质酶基因的表达和调控,以及木霉几亍质酶的生防应用前景等几方面进行了综述.     

Selection of antagonists from compost to control soil-borne pathogens

Journal of Plant Diseases and Protection - One-hundred and one microorganisms have been selected and tested for their antagonistic activity towards soil-borne plant pathogens from a compost...     

嗜线虫致病杆菌高产菌株的选育

用 4种诱变方法 (紫外线、氯化锂、60 Co γ射线、自身代谢产物 )对嗜线虫致病杆菌进行了诱变处理。结果表明 ,菌株对各种诱变剂均比较敏感 ,低剂量诱变和复合诱变处理的菌株正变率较高 ,其中氯化锂加紫外线复合诱变的累加处理效果最好 ,效价提高了 6 0 %～ 70 % ;连续5代传代培养 ,其产素能力基本稳定。     

龟裂链霉菌M527荧光定量PCR内参基因的选择及其稳定性评估

龟裂链霉菌Streptomyces rimosus M527是龟裂霉素（rimocidin）的生产菌,其对多种植物病原真菌具有较强的拮抗作用。为从转录水平分析菌株M527以及其抗性突变株中龟裂霉素的合成调控机制,荧光定量PCR内参基因的选择与稳定性评估显得尤为重要。本研究选用16S rRNA_sr、hrdB_sr、rpoA_sr、sigF_sr、sigB_sr、gyrB_sr这6个基因作为候选内参基因,使用geNorm、NormFinder、BestKeeper三个软件分析在野生型龟裂链霉菌M527、高产龟裂霉素抗性突变株M527-GR7和低产龟裂霉素抗性突变株M527-GR21中候选内参基因的稳定性,筛选出稳定性最高的内参基因。结果显示,sigB_sr基因在菌株M527及抗性突变株M527-GR7和M527-GR21中表达稳定性最好。通过以基因sigB_sr、16S rRNA_sr、rpoA_sr为内参基因,检测龟裂霉素生物合成基因簇中的结构基因rimG_sr在菌株M527-GR7中不同时间的相对表达量,发现基因sigB_sr作为内参基因时能得到更准确的结果。     

Suppression of Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis in soybean stems by Chaetomium globosum

The effect of two isolates of Chaetomium globosum (CgA-1, a producer and CgNA, a non-producer of antibiotic in vitro ) on the sporulation of pycnidia and survival of Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis ( Dpm ) in soybean stems was determined under conditions of intermittent wetting and drying. Dpm -colonized stems placed on the surface of field soil or of quartz gravel were exposed to a 12- or 24-h wet period followed by a 48-h drying period until a cumulative wetness duration of 120, 240 or 480 h was attained. Both isolates reduced the pycnidia sporulation index to zero within 120 h of cumulative wetness duration if the wet period was 24 h. With a 12-h wet period the sporulation index decreased gradually, to between 4 and 8% after 480 h of cumulative wetness. In general, on the soil surface and with a 12-h wet period, CgA-1 reduced sporulation more efficiently than CgNA whereas with a 24-h wet period there was no difference between the isolates. Recovery of Dpm from C. globosum -treated stems decreased gradually with increase in wet period and cumulative wetness duration. The recovery rate from stems treated with isolate CgA-1 was always significantly less than that from stems treated with CgNA. In glasshouse experiments, disease incidence and the proportion of the stem length colonized by Dpm at the V₆ growth stage was reduced significantly when soybean seeds treated with ascospores of C. globosum were sown in Dpm -infested soil. Incorporation of bran inoculum of either of the isolates in the upper soil layer dramatically reduced disease incidence. Isolate CgA-1 reduced the disease more efficiently than CgNA.