应用PCR检测山羊痘病毒

初步建立了用于诊断山羊皮肤组织中山羊痘病毒的PCR方法。试验设计了2对引物，用以分别检测山羊痘病毒的特异性基因和α-微管蛋白基因。克隆到的DNA扩增产物的序列与GenBank中收录的序列同源性达到98％。试验表明，用PCR方法可快速检测样品中的山羊痘病毒。     

山羊痘病毒PCR/酶切检测方法的建立

为了建立一种快速的山羊痘检测方法,根据山羊痘病毒基因组保守区T3A/T3C基因设计了1对引物,以山羊痘病毒DNA为模板进行PCR扩增并连接到pMD18-T载体进行序列测定,测序结果显示片段长491 bp,与已报道的山羊痘病毒对应序列进行比对,同源性高达98%。特异性和灵敏性试验及PCR产物的酶切位点分析表明,该引物特异性好,敏感性强。本研究建立的山羊痘病毒PCR/酶切检测方法可应用于山羊痘病毒感染的临床诊断。     

山羊痘病毒PCR检测方法的建立及应用

为了更快、更准确的诊断山羊痘(Goat pox),根据GenBank上已公布的山羊痘病毒(GTPV)的基因序列,针对p32基因的保守序列设计并合成一对能特异性扩增山羊痘病毒的引物,扩增产物大小约为983bp。经过反应条件的优化,建立了山羊痘病毒PCR检测方法,对所建立的PCR反应体系的特异性和灵敏性进行了评价,并用此方法对9份临床样品进行了检测。结果显示,该诊断方法与3种非羊痘病毒不发生交叉反应。该方法最低浓度检测限为0.4pg。在检测的临床样品中,GTPV阳性有3份。结果表明,所建立的方法具有良好的特异性和敏感性,适合临床诊断应用。     

快速鉴别诊断山羊痘病毒和羊口疮病毒二联PCR方法的建立

参照GenBmk已发表的山羊痘病毒(GPV)和羊口疮病毒(ORF)的核苷酸序列设计了两对引物,建立了一种可以快速鉴别山羊痘病毒和羊口疮病毒二重PCR方法,检测结果显示,对山羊痘病毒和羊口疮病毒可以分别扩增出413 bp和595 bp的特异性片段,经敏感性测定,最低能检测到4 pg的DNA。对广西的送检的山羊病料20份进行检测,其中7份可扩增出413 bp的山羊痘特异片段、1份可扩增出595 bp的羊口疮特异片段。该方法能在4 h内完成整个检测过程,不仅快速,而且特异强、敏感性高,很适合于快速诊断。     

绵羊痘病毒PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒(CaPV)P32和ITR基因序列,设计合成了2对引物,建立了不同基因片段检测羊痘病毒核酸的PCR方法。结果表明针对2种基因的PCR方法敏感性较高,最小DNA检出量分别为20.15 ng(P32)和25.80 pg(ITR);扩增禽痘疫苗毒株、羊口疮病毒细胞培养物、口蹄疫病毒细胞培养物,结果均为阴性,特异性较强。扩增产物进行序列分析,与GenBank收录的其他株病毒P32核苷酸同源性为99.5%～99.9%,与ITR基因同源性为98.3%～100%。本方法为羊痘的快速诊断提供了可靠、简便的检测技术。     

羊痘病毒PCR检测方法的建立和试剂盒的研制

根据GenBank上已发表的羊痘病毒(CPV)的全基因序列,设计并合成了一对能特异性扩增羊痘病毒的引物,扩增产物大小约为445bp。通过对PCR方法的优化,建立了检测羊痘病毒的PCR方法,并研制出检测试剂盒。同时对试剂盒的敏感性,特异性和稳定性进行了研究。实验结果表明,该试剂盒具有良好的敏感性和特异性,稳定性在-20℃至少可以保存一年。     

羊痘病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

为建立羊痘病毒(CaPV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据GenBank中羊痘病毒的保守基因序列,设计出针对羊痘病毒的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪优化得到病毒核酸等温扩增最佳条件是62 ℃恒温反应60 min。在此条件下,病毒核酸的最低检测含量为3.1×10^-2 pg/μL,灵敏度比OIE推荐的PCR方法高10⁴倍。添加钙黄绿素(calcein)建立的目测法,还可实现对上述病原体检测结果肉眼观察。本研究获得的CaPV LAMP仪器法和目测法可特异性地扩增羊痘病毒属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒核酸,具有反应快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、设备要求低等特点。     

感染细胞与痘疹样本中山羊痘病毒PCR检测方法的建立

比较Trizol法和SDS-蛋白酶K法提取山羊痘病毒DNA后,根据山羊痘病毒P32基因设计引物,建立了能检测感染细胞培养物与组织病料的PCR方法,结果显示以SDS-蛋白酶K法提取的病毒DNA在含量与纯度上均明显高于Trizol法;该PCR方法对山羊痘标准毒株细胞感染物能扩增出特异性的DNA条带,最小检出量为40.625ng;且能检出山羊痘疫苗毒Y株、贵州现场分离毒LD株和QL株的细胞感染物以及山羊痘疹样本中病毒DNA,而对鸡痘疫苗毒株感染细胞、正常细胞及正常山羊皮肤均为阴性反应。这些结果表明,建立的PCR方法具有特异性强、可靠性好、灵敏度高等特点,可用于山羊痘的临床诊断。     

羊痘病毒多重PCR检测方法的建立

根据羊痘病毒（CaPV）末端反向重复序列中的一段序列和P32基因序列,设计合成了2对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊痘病毒核酸的多重PCR方法。结果显示,用这2对引物均能扩增出羊痘病毒相应的特异性片段,而用此PCR方法检测口蹄疫病毒和羊口疮病毒,结果均为阴性。与中和试验比较,建立的PCR方法具有更好的敏感性。表明,该PCR方法可对组织病料中的CaPV进行快速检测。     

山羊痘病毒不同基因片段PCR诊断方法的研究

山羊痘(goat pox)是由羊痘病毒属(Capripoxvirus)山羊痘病毒(Goat poxvirus,GPV)引起山羊及绵羊的一种急性、热性、高度接触性传染病.本试验根据GenBank上公布的山羊痘病毒P32基因与ITR(inverted terminal repeat)基因序列设计2对特异性引物,比较2对引物扩增山羊痘病毒基因的特异性、敏感性,并将扩增片段进行了克隆、测序,分析基因片段的同源性,拟为山羊痘的诊断提供快速、可靠、简便的诊断与检测技术.     

云南流行山羊痘病毒的PCR鉴定及基因序列分析

2003年,在云南省的多个地州暴发了山羊痘.我们根据国外山羊痘病毒基因序列,设计1对聚合酶链反应(PCR)引物,用于扩增羊痘病毒的SVF基因,建立PCR诊断方法.     

山羊痘、羊口疮及山羊传染性胸膜肺炎混合感染的检测与分析

利用特异性PCR方法从病山羊组织病料中分别扩增山羊痘病毒、羊口疮病毒和山羊支原体山羊肺炎亚种特异性片段,继而将扩增的特异性片段克隆、测序,并与GenBank上相应的基因序列进行比对、绘制系统进化树,进行流行病学分析。结果表明,从病山羊中可同时扩增出山羊痘病毒、羊口疮病毒和山羊支原体山羊肺炎亚种特异性片段,并通过基因序列比对分析确证了PCR检测结果,首次证实我国存在山羊痘、羊口疮及山羊传染性胸膜肺炎的混合感染,为我国现阶段羊病的流行病学和有效防制措施的制定提供了参考依据。     

山羊痘病毒与小反刍兽疫病毒双重PCR检测方法的建立

为建立一种灵敏、准确、快速的山羊痘病毒(GTPV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)双重PCR检测方法,根据GenBank上登录的GTPV、PPRV两种病毒的基因序列设计检测引物,在常规PCR基础上,对反应条件及反应体系进行优化,建立了这两种病毒的双重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性检验。结果显示:仅GTPV和PPRV核酸样品扩增出与预期目标相符的目的片段,而其他病原对照均未出现目的条带;GTPV的最低检出量为0.283 ng/μL,PPRV的最低检出量为6.459 ng/μL。结果表明,本研究建立的双重PCR检测方法可一次性同时完成PPRV、GTPV两种病原的检测,且具有较高的特异性和敏感性。本方法的建立为山羊痘和小反刍兽疫的临床诊断、流行病学研究、疫情监测提供了技术支持。     

羊痘病毒

羊痘病毒能引起山羊痘、绵羊痘和牛的结节性疹块病.作者着重综述山羊痘和绵羊痘.羊痘病毒的基因组较大,山羊痘病毒和绵羊痘病毒的基因组非常相似,但自然条件下一般不会发生交叉感染.临床症状主要以发热和全身性丘疹或结节为特征,结合其临床症状实验室用透射电子显微镜检测病毒粒子的典型形态即可做出快速诊断.病毒培养和分离虽有较高的特异性,但耗时长;因羊痘病毒和副痘病毒有相似的血清型,一些血清学的诊断方法如琼脂扩散试验(AGID)、间接免疫荧光试验、检测抗体的ELISA等,因会出现抗体交叉反应而无法区分这2种病毒的感染;又因羊痘感染后主要引起细胞介导免疫,动物接触病原后仅产生低水平的中和抗体,故而病毒中和试验敏感性也不高.近年来,用于ELISA检测抗原的方法已经建立,具有较高的特异性;Western印迹试验利用羊痘病毒的P32抗原与待检血清反应,具有较好的敏感性和特异性,但价格昂贵、操作难.PCR可用来检查活体或组织培养品中羊痘病毒基因组;在此基础上发展了多重PCR技术,不但敏感性和特异性更强,且大量节省了时间和精力.治疗羊痘病毒无特效药,做好疫苗接种等防制措施很关键;目前采用活疫苗和灭活疫苗来控制本病,所有被鉴定的羊痘病毒毒株都有一个相同的主要中和位点,可以交叉保护.灭活苗的免疫保护期短.以羊痘病毒基因组作为其他反刍动物病原基因的载体,生产新一代羊痘病毒基因工程疫苗,具很大潜力.     

羊痘病毒属病毒多重TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立同时快速鉴别检测羊痘病毒属病毒(CaPV)的方法,本研究设计了一对针对CaPV的通用引物和3条特异性的TaqMan MGB探针,并对其反应条件进行优化,建立了单管同时鉴别检测3种病毒的多重TaqMan MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该多重荧光定量PCR方法仅对牛结节性皮肤病病毒(LSDV)、山羊痘病毒(GTPV)和绵羊痘病毒(SPPV)有特异性扩增,而对牛痘病毒等其它相关病毒核酸无扩增。在10~2拷贝/μL～107拷贝/μL浓度范围内有良好的线性关系;对LSDV、 GTPV、SPPV的最低检测限分别为14.8拷贝/μL、32.9拷贝/μL、26.7拷贝/μL。标准曲线相关系数(R2)均为0.999。批内及批间变异系数均小于1.5%。应用本研究建立的方法和OIE陆生动物手册推荐普通PCR方法分别对185份临床样品和67份模拟样品进行检测,该方法检出率比普通PCR方法高约1.6%。本研究建立的CaPV多重TaqMan-MGB荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便快速等优点,适用于CaPV临床样品的快速鉴别检测。     

鸭瘟病毒PCR检测方法的建立与优化

为了快速、准确诊断鸭瘟病毒,根据Gen Bank中登录的鸭瘟病毒基因(UL51)序列,设计合成1对特异性引物,以鸭瘟疫苗株病毒基因组DNA为模板进行PCR扩增;优化PCR扩增程序中的延伸时间、退火温度、循环次数,并对方法的敏感性和特异性进行验证。结果表明:PCR方法经优化后可扩增得到916 bp的目的条带,同预期相符;该方法的最低检出浓度为1.041μg/m L,对其他7种常见鸭易感性病原体的检测结果均为阴性。说明该诊断方法的特异性好、灵敏度高,同时操作快速、简单,可应用于实验室快速诊断鸭瘟病毒。     

羊传染性脓疱病毒PCR检测方法的建立与应用

根据羊传染性脓疱病毒GeneBank基因序列,设计合成一对引物。通过对PCR反应条件的优化,敏感性及特异性试验,成功建立了用于检测羊传染性脓疱病毒DNA的PCR检测方法。该方法成功扩增出390 bp的目的基因片段,敏感性试验证明可以检测出320×10~(-2)ng/L的DNA。特异性试验羊痘病毒、山羊关节炎脑炎病毒均未扩增出相应片段。重复性试验对3份羊传染性脓疱病毒阳性病料进行检测,结果均为阳性。临床应用对临床送检的16份疑似羊传染性脓疱病毒感染病料用上述建立优化的PCR方法进行检测,结果显示,9份为阳性,阳性样品的PCR扩增产物克隆后进行序列分析显示均为羊传染性脓疱病毒。证明该方法具有良好的敏感性和特异性,可以用于临床诊断。     

绵羊痘病毒、山羊痘病毒及羊口疮病毒多重PCR检测方法的建立和应用

为了建立鉴别绵羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和羊口疮病毒(ORFV)的多重PCR检测方法,针对GenBank中3种病毒的基因组序列,合成了3对引物,通过优化多重PCR反应条件,建立了鉴别检测3种病毒的多重PCR方法。特异性试验表明,应用该方法可分别扩增出3种病毒对应的目的片段,对大肠埃希菌、沙门菌、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、Vero细胞、正常羊组织的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验表明,该方法最低检测量分别为30.46pg/μL的绵羊痘病毒、28.9pg/μL的山羊痘病毒和26.94pg/μL的羊口疮病毒基因组DNA;应用本方法对85份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单项PCR检测方法结果一致,说明该方法可以用于临床上SPPV、GTPV和ORFV的鉴别诊断。     

绵羊肺腺瘤PCR诊断方法的建立及应用

利用特异性PCR方法实现对绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)快速精确诊断和病毒类型的分析.参照GenBank中公布的外源性绵羊肺腺瘤病毒基因序列,针对病毒env基因YXXM基序设计了特异性PCR引物,建立了特异性PCR检测方法.成功扩增出病毒囊膜基因(env)多变区序列片段(ST)通过序列比对确定病毒类型.此方法操作简便,可用...     

山羊痘病毒和羊口疮病毒双重PCR检测方法的建立与初步应用

根据GenBank发表的山羊痘病毒（goatpox virus,GPV）和羊口疮病毒（orf virus,ORFV）基因序列,分别合成针对GPV ITR和ORFV H2L基因片段的2对引物,以GPV和ORFV的核酸混合物作为模板,经优化反应条件,成功建立了快速鉴别检测GPV、ORFV的双重PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对GPV与ORFV核酸的扩增能获得289和507 bp的特异性目的片段,而对FMDV、FPV、BTV、健康山羊皮肤的核酸扩增均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对GPV核酸的最小检出量为4 pg,对ORFV核酸为0.4 pg;对临床采集的12份病料进行双重PCR扩增,GPV检出率为25%（3/12）,ORFV的检出率为75%（9/12）。结果表明,建立的双重PCR方法具有特异性强、敏感性高、快速简便等特点,可用于GPV或/和ORFV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。