番茄Ty-1、Ty-2和Ty-3基因的多重PCR技术鉴定

试验探索在同一个反应体系中完成3个SCAR标记的多重PCR扩增,为利用分子标记辅助番茄黄化曲叶病抗性育种提供一种省时、省力、经济有效的方法。对分别与番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3紧密连锁的共显性SCAR标记同时进行扩增筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段一致。     

番茄抗病基因Ty-1的CAPS标记及检测

为了获得番茄抗病基因Ty-1的分子标记,利用特异引物对3份抗病纯合材料（基因型Ty-1/Ty-1）和3份感病纯合材料（基因型ty-1/ty-1）进行PCR扩增,抗病、感病材料均产生400 bp的PCR扩增片段,感病和杂合抗病材料的酶切产物存在RsaⅠ酶切位点,酶切后分别产生了350、50 bp以及400、350、50 bp的片段,而抗病纯合材料的扩增产物无此酶切位点,酶切后仍为400 bp的片段。该标记能够区分抗病材料、感病材料及杂合抗病材料,是与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对33份番茄F1进行检测,有20份材料含有抗病基因Ty-1,13份材料不含抗病基因Ty-1。利用该标记对国内的24份番茄自交系进行检测,24份材料均不含抗病基因Ty-1。经反复验证,结果准确可靠,该标记可以用于对番茄抗病基因Ty-1的筛选鉴定。     

利用多重PCR反应同时鉴定番茄Ty-3a基因和抗溃疡病QTL

番茄黄化曲叶病毒病和番茄溃疡病是两种分布广泛、危害严重的世界性病害,严重影响了番茄的产量,是国内外番茄抗病育种的重要目标。为了提高抗病育种的效率,研究建立了抗番茄黄化曲叶病毒病Ty-3a基因和抗番茄溃疡病QTL的多重PCR反应体系。该体系利用同一PCR反应,对分别与番茄抗黄化曲叶病毒病的Ty-3a基因和抗番茄溃疡病的一个QTL位点Rcm5.1紧密连锁的标记进行了扩增、筛选,扩增的特异性片段与单引物扩增片段吻合。其中与Ty-3a基因紧密连锁的标记Ty-3F/Ty-3R为共显性标记,基因型为Ty-3a/Ty-3a的材料均产生630 bp的特异性片段,基因型为ty-3/ty-3的材料均产生320 bp的特异性条带,基因型为Ty-3a/ty-3的材料产生630 bp和320 bp的特异性片段;与番茄溃疡病QTL位点Rcm5.1连锁的标记TG318F/TG318R为显性标记,只有抗病材料产生580 bp的特异性片段,感病材料不产生特异性条带。经反复验证结果准确、稳定,可用于同一PCR反应体系中对番茄抗黄化曲叶病毒病Ty-3a基因和番茄溃疡病QTL的同时筛选鉴定。     

番茄黄化曲叶病毒抗病基因Ty-2的SCAR标记筛选

以抗病杂合体(Ty-2/ty-2)、抗病纯合体(Ty-2/Ty-2)和感病纯合体(ty-2/ty-2)番茄为试材,以提取植物的基因组DNA作为模板,根据与抗病基因Ty-2紧密连锁的RFLP标记设计特异引物,采用DNA聚合酶链式反应的方法,筛选获得了2个与抗病基因Ty-2紧密连锁的、且稳定可靠的SCAR标记,分别命名为T0302-1和T0302-2。结果表明:T0302-1和T0302-2两个标记均为共显性分子标记,可用于番茄抗病育种的辅助选择中。该研究旨在筛选获得与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-2紧密连锁的分子标记,为番茄抗病育种提供技术支撑。     

番茄抗病基因Sw-5和Ty-3a的多重PCR检测体系的建立

以含有斑萎病毒和黄化曲叶病毒抗病基因和感病基因的番茄为试材,采用多重PCR方法,建立番茄抗斑萎病毒Sw?5和抗番茄黄化曲叶病毒的Ty?3a基因同时扩增的体系,以期为番茄分子标记抗病育种提供更省时、省力、经济的方法。结果表明:多重PCR扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全一致,与Sw?5基因紧密连锁的SCAR标记,在抗病基因型中可扩增出574bp的条带,感病基因型中扩增出464bp的条带;与Ty?3a基因紧密连锁的SCAR标记,在抗病基因型中可扩增出630bp的条带,感病基因型中扩增出320bp的条带,多重PCR体系可在同一PCR反应体系中对2个抗病基因进行筛选鉴定及苗期早期辅助选育。     

番茄黄化曲叶病毒病抗病基因 TY-1的 PCR 检测

利用特异引物对3份抗病纯合材料(基因型Ty-1/Ty-1)和4份感病纯合材料(基因型ty-1/ty-1)进行PCR扩增,抗、感材料均产生398bp的PCR扩增片段,抗病和杂合抗病材料的酶切产物存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了303和98bp以及398、303和98bp的片段,而纯合感病材料的扩增产物无此酶切位点,酶切后仍为398bp的片段。该标记能够区分抗病材料、感病材料及抗病杂合材料,是与番茄黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1紧密连锁的共显性标记。利用该标记对13份番茄杂交种进行检测,有8份杂交种含有Ty-1抗病基因,3份材料不含Ty-1抗病基因。利用这条标记对国内的13份番茄自交系进行检测,13份材料均不含Ty-1抗病基因。     

利用PCR技术同时鉴定番茄抗根结线虫和抗斑萎病毒基因

 利用同一PCR反应体系，对分别与番茄抗根结线虫的 基因和抗斑萎病毒(1w V)的Sw一5基因紧密连锁的SCAR标记进行了同时扩增筛选，扩增的特异性片段与单引物扩增片段完全吻合，其中与基因紧密连锁的SCAR1标记为共显性标记，抗感试材均产生750 bp的特异片段，纯合和杂合抗病基因型试材存在 I酶切位点，酶切后分别产生了570 bp、160 bp和750 bp、570 bp、160 bp的不同特异性片段，而感病基因型试材无 I酶切位点；与Sw一5基因紧密连锁的SCAR2标记为显性标记，只有抗病试材扩增出400 bD的特异性片段。经反复验证，结果稳定准确可靠，可用于在同一PCR反应体系中对两个抗病基因进行同时筛选鉴定。     

番茄抗TYLCV 基因新标记的开发及其在多抗聚合选择中的应用

根据已经克隆的番茄黄化曲叶病毒病（TYLCV）抗性基因Ty-1/Ty-3 和与基因Ty-4 紧密连锁的分子标记在抗感材料中的序列差异，开发出简单可靠的InDel 标记，建立了多重PCR 体系。采用分子标记辅助选择将TYLCV、斑点病、疮痂病和溃疡病中一个病害的多个抗性基因或不同病害的抗性基因聚合到一个材料中，培育出育种中间材料。     

126份番茄材料的抗性基因分子标记检测

利用分子标记技术,对56份大、中果型番茄进行烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a、番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3、叶霉病抗性基因Cf-9、晚疫病抗性基因Ph-3、枯萎病抗性基因I-2和根结线虫病抗性基因Mi-1 8个抗性基因的检测,对70份小果型番茄进行Tm-2a、Ty-1、Cf-9、I-2、Mi-1 5个抗性基因的检测。共获得含烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a的材料71份;在番茄黄化曲叶病毒病的3个抗性基因方面,含纯合抗性基因Ty-1的材料7份,杂合16份;含杂合抗性基因Ty-2的材料1份;含纯合抗性基因Ty-3的材料5份,杂合7份。真菌性病害方面,含叶霉病抗性基因Cf-9的材料101份;含纯合晚疫病抗性基因Ph-3的材料1份,杂合6份;含枯萎病抗性基因I-2的材料68份;含根结线虫病抗性基因Mi-1的材料45份。供试番茄材料中,DHG-27同时含有7个抗性基因;含有6个抗性基因的材料有5份,分别为:DHG-11、DHG-20、DHG-34、ZHG-8、HG-4;含有5个抗性基因的有HG-3、XHG-352份材料。     

多抗、耐贮存番茄育种材料的创制

利用多基因聚合技术,以番茄材料13485(含Cf-5、Tm-1、Mi-1基因)作母本,分别以番茄高代自交系13065(含Ty-2、Ty-3、I-2、Ph-2、Ph-3基因)和高代自交系13337(含耐贮存基因rin)作父本配制杂交组合。利用分子标记辅助选择(MAS)技术对2个组合的F2分离群体的1057个单株进行基因型鉴定,共获得抗5种病害的番茄材料19株,抗4种病害的材料30株,抗3种病害且含rin基因的材料20株。选择田间表现优良的单株留种以进行后续的选择,同时结合人工接种鉴定验证分子标记鉴定的准确性,结果表明,人工接种鉴定与分子标记鉴定结果吻合度均在80%以上。     

番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-1的双重SNP标记的开发

本试验旨在开发一种新的设计共显性SNP标记的方法,以提高SNP标记检验的效率,并将其成功应用于番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty-1的SNP标记开发中,提高了种质资源鉴定和育种分离世代材料筛选的效率。通过对抗病基因Ty-1和等位感病基因ty-1的cDNA序列进行比对,挑选了两个稳定扩增的多元非同义突变位点,分别用来设计Ty-1和ty-1的SNP标记NL3和NL2,将两个标记进行混合得到双重SNP标记NL2-3。通过用NL2-3检验已知的抗病和感病番茄材料,验证了其多态性和稳定性。并用NL2-3对抗感病材料的F₃代杂交分离群体和普通自交系进行了Ty-1的筛选,并经过田间观察进一步验证了该标记的可靠性。此方法开发得到的双重SNP标记只需要进行一次PCR反应和一次凝胶电泳就可以区分纯合抗、杂合抗、纯合感3种基因型,提高了育种选择的效率。     

百合无症病毒16kD基因的克隆、原核表达及抗血清制备

以感染百合无症病毒(LSV)的百合叶片为试材,克隆LSV16 k D基因,连接到原核表达载体p ET-28a(+)上。将获得的重组质粒p ET-28a(+)+16 k D转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到了高效表达的16 k D蛋白,融合蛋白分子量约为20 k D。融合蛋白经过镍柱纯化后作为抗原免疫注射小鼠,制备得到16 k D蛋白抗血清。Western blot分析显示所制备的抗血清与诱导表达的融合蛋白发生特异性反应;通过ELISA检测和RT-PCR检测百合样品,证实制备的抗血清与LSV侵染的百合叶片发生了相同的特异性反应。结果表明,目的蛋白表达成功,所制备的抗血清具有特异性,可用于LSV的快速检测、免疫组织化学以及16 k D蛋白功能研究。     

Gene cloning,prokaryotic expression,purification and characterization of CAD-caspase activated DNase

AIM：To construct a the plasmid pCool-GST-ICAD/CAD that expresses the CAD protein with biological function in E.coli BL21(DE3)strain.METHODS：CAD was amplified by PCR and inserted into pCool-GST-ICAD to create pCool-GST-ICAD/CAD.The plasmid was checked and transfected into BL21 for expression.The expressed protein were purified by using the GST affinity column,ion exchange and the gel filtration.Protein purity was checked by SDS-PAGE.CAD activity was checked by DNA fragmentation test.RESULTS：Plasmid pCool-GST-ICAD/CAD was constructed as design.The expression of GST-ICAD/CAD protein complex at mg level was observed.After purification,ICAD/CAD protein complex were obtained.Two clear protein bands were shown on SDS-PAGE.The DNA fragmentation test shows that the purified CAD protein indeed had the nonspecific DNase activity.CONCLUSION：Cloning and purification of CAD protein was successful with intact biological activity.     

黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因CsGAPDH的克隆及其涝胁迫响应分析

以黄瓜耐涝品系‘早二N’根组织总RNA为模板,运用RT-PCR结合RACE技术,获得了黄瓜3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（CsGAPDH）的cDNA全长序列,基因编码区共1011bp,编码336个氨基酸（GenBank登录号HQ156465）。系统进化分析表明：CsGAPDH基因与胡萝卜、葡萄、大豆等双子叶植物同源基因的核苷酸序列相似性均在88%以上,与单子叶植物水稻和玉米同源基因的相似性达86.8%和86%。qRT-PCR表达分析结果表明：CsGAPDH基因快速响应涝胁迫,在涝胁迫2h,该基因在根中表达量达到对照水平的12倍,在涝胁迫12h达到表达高峰,随后表达量呈现逐渐下降趋势;CsGAPDH基因在‘早二N’的根、茎、叶中均有表达,根和叶中原始表达量高于茎,在涝胁迫4h后均诱导表达,根中诱导表达量上调幅度最大,为初始表达量的4倍。CsGAPDH属于黄瓜涝胁迫响应基因,在缓解涝胁迫伤害过程中可能具有重要的调控作用。     

雏菊rbcL基因的克隆及其生物信息学分析

以雏菊为试验材料,采用PCR方法扩增雏菊rbcL基因并测序,并用DNAstar、PAML等生物软件对该基因进行生物信息学及其适应性进化研究。结果表明:雏菊rbcL基因序列全长1 508bp,编码区全长1 458bp,共编码485个氨基酸,与基因库中菊科其它属植物比较,核苷酸和氨基酸序列的同源性均超过了96%。rbcL蛋白二级结构主要有20个α螺旋、17个β折叠、33个转角以及一些无规则卷曲,适应性进化检测发现共有3个正选择氨基酸位点(94E,149Q,309M)。获得完整雏菊rbcL基因有助于更深地研究雏菊对其生境的适应,rbcL蛋白大亚基正选择位点的空间结构对于维持核酮糖结构具有重要的作用。