‘凤丹’牡丹PoERF113基因的克隆及表达分析

为克隆‘凤丹’(Paeonia ostii)花瓣衰老相关基因PoERF113的序列,分析其编码蛋白性质,探索其在不同发育时期花瓣、不同组织和不同品种的表达模式及对乙烯的响应,采用RT–PCR技术,从‘凤丹’牡丹中克隆到花瓣衰老相关基因PoERF113。该基因属于AP2/ERF家族,其开放阅读框(ORF)为636bp,编码1个由211个氨基酸残基组成的蛋白,含有1个AP2保守结构域,不包含跨膜结构,蛋白相对分子质量约为53 000,理论等电点(pI)为5.13,为不稳定蛋白,具有亲水性;qRT–PCR分析结果表明,PoERF113基因在露色期、初开期、半开期、盛开期、始衰期、衰败期均有表达,主要在‘凤丹’露色期的花瓣和叶片中表达;在早花‘凤丹’突变株系中表达量最高;PoERF113基因在早花‘凤丹’突变株系与‘凤丹’中的序列相同,不存在碱基差异;PoERF113基因对乙烯有响应,其表达量随处理时间和生育进程的延长呈逐渐升高的趋势,推测该基因可能与乙烯诱导后导致花衰老进程相关。     

蝴蝶兰PhaSEP3基因的克隆及其在突变体中的表达

E类MADS-box是花器官发育分子模型中必不可少的基因,通过突变体研究其表达模式将为深入理解兰科植物花器官的分子机理与完善花发育调控理论提供依据。采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术从蝴蝶兰花瓣中克隆了一个E类MADS-box基因PhaSEP3(GenBank登录号为MZ436812),并采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析了该基因在蝴蝶兰不同组织和5种突变体中的表达水平。结果表明,该基因cDNA全长为1 236 bp,具有753 bp的开放阅读框(ORF),可编码250个氨基酸,其C端具有SEPⅠ和SEPⅡ基序。系统进化分析显示,该基因编码蛋白质与蝴蝶兰属的PeSEP3和AGL9亲缘关系最近。组织特异表达分析表明,PhaSEP3基因主要在生殖器官和授粉后子房中表达;在不同突变体中,PhaSEP3基因在侧萼唇瓣化突变体的萼片和唇瓣中表达水平显著升高;在退化雄蕊瓣化突变体的侧瓣、唇瓣和子房中表达水平显著降低,在蕊柱中的表达水平显著升高;在侧瓣唇瓣化突变体的侧瓣和唇瓣中表达水平显著升高;在侧瓣退化突变体的侧瓣中表达水平显著降低,而在蕊柱和子房中表达水平显著升高;在侧瓣雄化突变体中,该基因的表达水平在萼片和侧瓣中均显著升高。分析认为,PhaSEP3基因主要调控蝴蝶兰花器官各轮组织与授粉后子房的发育,在突变体花器官中,PhaSEP3类基因可能与其他花发育基因互作参与花器官形态的发育调控。该研究结果为进一步理解兰科植物花器官多样性的调控机理提供了资料。     

鹤望兰二氢黄酮醇-4-还原酶基因SrDFR的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法从鹤望兰蓝色花瓣中克隆到类黄酮合成途径关键基因 S rD FR ,该片段长246 bp ,编码82个氨基酸。氨基酸同源性分析表明, SrDFR推导的氨基酸序列与已报道的其他植物的DFR蛋白具有很高的同源性。系统进化树分析显示,鹤望兰 S rD FR与姜荷花聚为一类,亲缘关系较近。应用半定量 PCR分析表明, S rD FR在蓝色花瓣中高表达,在黄色花萼和叶片中低表达,且在花发育的始花期表达量最高,表明该基因在蓝色花瓣发育过程中起着重要作用。     

枣SEP1基因的克隆和表达分析

SEP类基因属于E类MADS-box基因,在植物花器官发育中发挥重要作用。该研究以‘冬枣’为试材,采用同源克隆和RT-PCR技术从枣中分离到1个SEPALLATA1基因,并进行生物信息学及转录表达分析。序列分析表明,该基因包含完整的开放阅读框为735bp,编码244个氨基酸,预测分子量为27.9247kDa。系统进化树显示,该蛋白与其他植物SEP1类蛋白具有较高的同源性,命名为ZjSEP1(登录号为:KU375248)。实时荧光定量分析表明,ZjSEP1在枣不同组织中表达有显著差异,在蕾、花、幼果等生殖器官中高丰度表达,尤其是花发育前期表达最高;该基因在雄性不育和可育品种中表现出不同的表达模式,初步认为ZjSEP1基因可能在枣花器官的形成过程中发挥一定调控作用。     

蕙兰CfMADS1基因的克隆及其时空表达特性

【目的】对蕙兰CfMADS1基因cDNA全长进行克隆和时空表达特性研究,为研究成花相关基因的功能提供参考。【方法】以蕙兰萼片cDNA为模板,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,克隆获得CfMADS1全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。以蕙兰各时期的器官组织为材料,利用荧光定量PCR进行该基因的时空表达分析。【结果】成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登录号为KC148540),其cDNA序列全长1 061bp,开放阅读框长744bp,编码247个氨基酸,分子式为C1 244H2 040N370O377S9。其编码的氨基酸序列与AP1/FUL亚家族中金钗石斛MADS1具有较高的同源性(85.43%),与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。该基因编码蛋白没有明显的信号肽和跨膜域,极可能位于细胞核内,具有MADS保守域(1-61aa)和相对保守的K区(87-178aa),而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML),二级结构中α-螺旋所占比例较高(55.63%),三级结构与月季、水稻和水仙MADS1蛋白结构非常相似。该基因在盛花期叶中表达最强烈,花蕾期叶、葶、蕾及营养期叶、盛花期葶中表达较为强烈,子房和营养期根中表达较弱,其余器官组织中表达痕量。【结论】从蕙兰萼片中克隆得到了CfMADS1cDNA全长序列,CfMADS1与蕙兰的成花诱导、花发育以及果实形成有关。     

桂花OfAP1基因的克隆及表达分析

AP1（APETALA1）基因在植物花分生组织及花器官形成过程中发挥着重要作用。以桂花品种‘堰虹桂’Osmanthus fragrans‘Yanhonggui’为材料,根据前期获得的转录组数据中AP1的序列设计引物,利用PCR技术,克隆得到约750 bp桂花AP1 cDNA序列,即OfAP1基因,其中开放阅读框长为720 bp（注册号为MH593222）。氨基酸序列比对发现,与其他物种的AP1基因的同源性高达69%~88%。荧光定量PCR结果表明:在不同组织中,桂花的OfAP1基因在花芽中的表达量显著高于其他组织,根中几乎不表达;在花芽分化过程中,OfAP1在成花转变及花芽分化初期（花瓣、花萼分化期）表达量较高,随后呈下降趋势。这说明OfAP1具有组织表达特异性,同时在桂花成花转变、花芽分化和发育中有重要作用。     

紫薇花器官发育调控基因LiFUL1的分离与表达分析

紫薇湘韵具有只开花不结实的特性,表现为花药不开裂、花粉败育、胚珠发育异常。紫薇红叶为普通紫薇,可正常开花结实。以紫薇湘韵为试验材料,采用RT-PCR方法,从花芽中分离得到1个FRUITFULL(FUL)同源基因,命名为LiFUL1(GenBank登录号为MN894547)。序列分析结果表明,其cDNA开放阅读框长度为753 bp,编码251个氨基酸,分子质量为28.453 13 ku。序列比对和保守结构域分析结果表明,LiFUL1基因编码蛋白具有典型的MADS-MEF2和K-box 结构域,C末端含有一个保守性高的基序euFUL MOTIF,因此,LiFUL1属于MADS家族的FUL/AP1亚家族。进化分析表明,紫薇的LiFUL1基因编码的蛋白氨基酸序列与木本植物蓝桉的FUL/AP1氨基酸序列亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明,LiFUL1基因在紫薇湘韵花器官分化阶段的花萼分化时期、花瓣与雄蕊分化时期、雄蕊与雌蕊分化时期的表达量显著高于紫薇红叶。另外,利用原核表达系统在大肠埃希菌中成功表达了LiFUL1蛋白,为进一步研究LiFUL1基因的功能奠定了基础。     

OMA DS10和OAP3基因在文心兰各器官中的表达

为研究兰花MADS-box基因的表达与花器官发育之间的关系,以文心兰为材料,通过荧光定量实验对文心兰中AP1家族成员OMA DS10和AP3家族基因OAP3进行了表达分析.结果表明:OMADS10和OAP3基因在花芽生长的整个过程中都表达,且都在营养器官(叶片,茎)和花器官所有部位中表达,但表达量存在明显差异.OMADS10在合蕊柱中强烈表达,其次是花瓣.OAP3在花萼中强烈表达,其次是合蕊柱.     

春兰GLO基因的克隆和实时定量表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术从春兰(Cymbidium goeringii)中分离到一个GLO基因.该基因含有一个630 bp的开放阅读框(ORF),共编码210个氨基酸.系统进化树分析显示,该基因属于B类MADS-box基因的PI/GLO家族,其编码的蛋白与其他植物PI/GLO类蛋白具有很高的同源性,命名为CgGLO(登录号HM106984).实时荧光定量表达分析表明,CgGLO主要在第二轮花器官唇瓣和花瓣中表达,在萼片、子房和叶片中表达较少,在蕊柱和根中表达量最少,这种表达模式支持了van Tunen对ABC模型的修正,也显示了CgGLO基因可能在春兰花器官以及子房的形成过程中起着重要作用.     

百子莲CONSTANS同源基因的克隆及表达分析

根据前期百子莲转录组测序分析的结果,获得了1 个与光周期调控开花途径关键基因CONSTANS(CO)同源 性较高的核心片段。采用cDNA 末端快速扩增(RACE) 方法得到了百子莲CO 基因cDNA 全长序列,命名为 ApCOL,GenBank 登录号为KF683287。序列分析表明,百子莲ApCOL 基因cDNA 全长1 648 bp,5非编码区(5UTR) 和3非编码区(3UTR)分别为126 和355 bp,开放阅读框(ORF,127 ~ 1 293 bp)1 167 bp,编码388 个氨基酸。 ApCOL 具有CO 蛋白典型的结构域:氨基末端有2 个B-box 结构域,羧基末端有1 个CCT 保守结构域。氨基酸同源 性比对发现,ApCOL 与葡萄(XP_002274384.2)、可可(EOX99181.1)和大豆(NP_001241023.1)等植物的CO 蛋白有 很高的相似性,同源性均在50%以上。系统进化树分析表明,ApCOL 与小麦CO(EMS51329.1)聚类关系最近。实 时荧光定量qRT-PCR 结果表明:叶片中ApCOL 的表达量在花芽分化3 个时期均高于花芽中的表达量,且叶片中的 最高表达量和花芽中最低表达量均出现在花芽诱导期;在整个初花期内,各器官中ApCOL 表达量由高到低依次是 花梗、叶片、幼果、子房、花瓣、茎和花葶,花梗中表达量分别为叶片和茎中的2.68 和114.3 倍;不同光周期处理的叶 片中ApCOL 基因表达模式相近,均在暗处理时期呈现高表达。说明该基因的表达具有明显的时空差异性和生物钟 调节特性,推测ApCOL 在百子莲成花过程中以及花发育过程中发挥着一定的作用。