巴西橡胶树葡萄糖/核糖醇脱氢酶基因的克隆和表达分析

割胶显著刺激新开割橡胶树胶乳产量,前期的比较蛋白质组学的研究中,已通过双向电泳的方法分离到一个随割胶下调的葡萄糖/核糖醇脱氢酶(GRDH,glucose/ribitol dehydrogenase)。通过搜索本实验室的橡胶树EST数据库和PCR扩增得到该蛋白点对应的全长c DNA序列并命名为Hb GRDH1。序列分析显示,c DNA的编码序列(CDS)为882 bp,推测编码294个aa,分子量大小为32.2 ku,等电点为5.18,基因组序列包含4个外显子和3个内含子。通过Realtime PCR和Solexa高通量转录组测序分析发现,Hb GRDH1主要在胶乳和雌花中表达,在叶片发育稳定期呈现明显的下调表达趋势;在新开割树胶乳中,前4刀该基因表达变化不明显,而第5刀开始呈现上调表达趋势;在胶乳中,乙烯利处理对该基因表达前12 h无明显影响,在24 h时呈明显的下调表达。本研究结果有助于进一步阐明橡胶树中Hb GRDH1基因的功能,特别是其参与橡胶树胶乳再生调控的分子机理。     

不同采胶强度下橡胶树胶乳C-乳清蛋白的双向电泳初析

选取采胶强度分别为严重过度、适中、严重不足的橡胶树胶乳,高速离心分离得到C-乳清,提取C-乳清中的蛋白质进行双向凝胶电泳,并通过PDQuest软件分析比较.结果表明:采胶强度严重不足的与其它采胶强度的相比,橡胶树胶乳C-乳清的差异表达蛋白质点有17个,其中,14个点相对上调,3个点相对下调:采胶强度适中的与其它采胶强度的相比,橡胶树胶乳C-乳清的差异表达蛋白点质有12个,其中,5个点相对上调,7个点相对下调;采胶严重过度的与其它采胶强度的相比,橡胶树胶乳C-乳清的差异表达蛋白质点有14个,其中,8个点相对上调,6个点相对下调;随着采胶强度的增加而明显上调的蛋白质点有1个:发现采胶强度高的橡胶树较采胶强度低的橡胶树胶乳C-乳清蛋白质下调的数量更多,上调的数量更少.并且采胶强度相差越大.下调与上调的比例也越大.通过研究不同采胶强度下的橡胶树胶乳C-乳清蛋白质差异,找出采胶强度与胶乳C-乳清蛋白质的关系,并利用这种关系进行乙烯刺激采胶强度的判断,进而指导采胶生产和研究.     

乙烯利和乙烯刺激对橡胶树胶乳中几丁质酶活性和胶乳产量的影响

以巴西橡胶树无性系PR107,RRIM600,GT1为试验材料,研究乙烯利和乙烯刺激对胶乳黄色体中几丁质酶活性和胶乳产量的影响。结果表明:在乙烯利和乙烯的有效刺激浓度范围内,几丁质酶活性随乙烯利和乙烯浓度增加而增加;乙烯和乙烯利持续刺激一段时间后,几丁质酶活性达到最大值;3种不同排胶特性品系橡胶树在施用乙烯利刺激后胶乳中几丁质酶活性和胶乳产量较施用乙烯利刺激前均有所增加,其增加强度存在着品系差异,表现为:PR107>GT1>RRIM600。      

乙烯利诱导橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建

为解析乙烯利刺激巴西橡胶树橡胶增产的分子机制,应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)成功构建了乙烯利刺激条件下橡胶树胶乳与未处理橡胶树胶乳差异表达的cDNA消减文库。经蓝、白斑筛选,共得到了118个阳性克隆。菌落PCR分析结果表明,92%左右的阳性克隆含有大小200～500bp的插入片段。随机选取25个克隆进行了测序,并用基因检索工具(Genbank)对获得的EST进行了Blastx分析,结果表明,5个EST属于无任何序列线索的未知序列,6个属于未知功能的推测蛋白基因,2个属于未知功能的蛋白基因,3个与已知功能基因具有较高的同源性。应用半定量PCR技术,对编号203片段进行的表达分析结果表明,该片段为乙烯利诱导特异表达基因,在乙烯利处理后24h范围内随处理时间的增加而表达量增强,叶片中没有检测到该基因的表达。     

乙烯利刺激对橡胶树无性系RY8-79和PR107排胶生理参数的影响

以成龄橡胶树无性系RY8-79和PR107为材料,研究乙烯利刺激对胶乳中几种生理参数的影响。结果表明,在自然条件下,RY8-79和PR107的胶乳生理参数存在明显差异,甚至表现出相反的特征,其中RY8-79胶乳中硫醇和H2O2含量以及排胶初速度显著高于PR107,而黄色体破裂指数和堵塞指数显著低于PR107。乙烯利刺激后,RY8-79和PR107的排胶特性发生了一系列的改变,其中黄色体破裂指数都升高,而排胶初速度和堵塞指数均降低,2个品系表现出高度的一致性;但其它几个生理参数的变化在2个品系中表现不一。说明乙烯利刺激促进排胶与提高黄色体稳定性之间没有直接的联系;H2O2含量与黄色体破裂指数之间没有直接的关系。     

橡胶树HbGAIP-B基因的克隆与表达分析

DELLA是赤霉素信号传导途径中一类重要的阻遏蛋白。本研究通过RT-PCR技术,从橡胶树优良品种‘热研7-33-97’胶乳中克隆了1个DELLA蛋白编码基因(GenBank登录号为KT696440)。该基因全长cDNA序列2135bp,阅读框1905bp,编码634个氨基酸,其编码蛋白含有DELLA和GRAS结构域,分子量为69.89ku,理论等电点为5.50。HbGAIP-B氨基酸序列与麻疯树JcGAIP-B、蓖麻RcGAIP-B、拟南芥AtRGA、AtGAI、AtRGL1、AtRGL2和AtRGL3的相似性分别为82.43%、78.18%、65.05%、61.73%、52.28%、53.51%和49.92%。进化树分析表明,HbGAIP-B与JcGAIP-B亲缘关系最近。定量PCR分析表明,HbGAIP-B的表达受割胶处理诱导下调。赤霉素和乙烯利处理4h显著上调HbGAIP-B的表达,茉莉酸甲酯处理4h小幅下调HbGAIP-B表达。     

乙烯利对橡胶树乳管伤口堵塞相关蛋白基因表达和含量的影响

乳管伤口堵塞物的形成决定着排胶时间的长短,乙烯利刺激能显著延长排胶时间,但目前关于乙烯利刺激对乳管堵塞物的影响研究很少。以橡胶树无性系PR107为材料,利用荧光定量PCR和蛋白质Western-blot研究了乙烯利刺激对黄色体内含物相关蛋白的基因表达以及蛋白(包括黄色体和C-乳清中)的含量变化的影响,同时利用光学显微技术研究了割口表面蛋白质网形成的情况。结果表明:乙烯利刺激后PR107胶乳中HGN 1、Hevamine A及HEV 1这3个基因的相对表达量均显著性降低;黄色体中和C-乳清中对应的β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶以及橡胶素蛋白含量也显著性降低;而割口处割面形成的蛋白质网明显多于对照橡胶树,且随着排胶时间的延长蛋白质积累增多。     

橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因HbLEA1的克隆和表达分析

胚胎晚期丰富蛋白（LEA）是与植物抗逆反应相关的一类重要蛋白。本研究克隆了橡胶树LEA家族一个新基因的全长cDNA序列,命名为HbLEA1。该cDNA全长1 183 bp,其中5'UTR区60 bp,3'UTR区154 bp,CDS区969 bp,共编码322个氨基酸,分子量大小为36 ku,等电点4.84,含有LEA-2和WHy（Water Stress and Hypersensitive response）结构域,属于LEA_2类LEA蛋白。组织表达分析结果表明,HbLEA1在种子中表达量最高,其次是胶乳和稳定叶,在芽中的表达量最低。在未开割树的胶乳中,机械伤害和割胶处理均明显下调HbLEA1表达。在橡胶树幼苗中,低温胁迫处理后该基因在叶片、树皮和根中的表达呈上升趋势,而在高温和干旱胁迫中其表达变化并不明显。结果显示,HbLEA1基因可能参与橡胶树的胁迫应答和胶乳代谢调控。     

巴西橡胶树多聚遍在蛋白基因的表达分析

研究中发现橡胶树胶乳中的橡胶粒子膜上存在遍在蛋白（Ubiquitin)，天然橡胶就是在橡胶粒子上合成的，一些与橡胶合成相关的酶或蛋白就位于橡胶粒子膜上，为了探讨多聚遍在蛋白（Polyubiquitin)基因在天然橡胶合成中可能的调节作用，对橡胶树Polyubiquitin基因的表达进行了研究，Northern blot分析表明，Polyubiquitin基因在橡胶树叶片，树皮和胶乳中都表达，在胶乳中的表达量比叶片和树皮中的高。用外源乙烯和茉莉酸处理的末开割橡胶树和开割橡胶树进行处理后，均可引起Polyubiquitin基因表达增强，未开割橡胶树对外源乙烯和茉莉酸处理比开割橡胶树的反应敏感。     

橡胶树胶乳WRKY家族转录因子HbWRKY27基因的克隆与表达分析

从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了1个WRKY转录因子家族成员基因,命名为HbWRKY27,该基因含有1个1 266 bp的开放阅读框(ORF),编码422个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbWRKY27含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序,属于II类WRKY家族成员,与大豆、油棕、麻风树、葡萄和拟南芥的WRKY27蛋白的同源性分别为81%、74%、63%、62%和58%。酵母转化试验表明,HbWRKY27具有转录激活活性。实时荧光定量RT-PCR分析显示,HbWRKY27基因在健康橡胶树树皮组织中表达量最高,但在死皮橡胶树树皮组织中的表达量随着死皮程度的增加而下降,而在死皮橡胶树胶乳中HbWRKY27基因表达量则随着死皮程度的增加而升高;割胶、乙烯利和茉莉酸甲酯刺激都可显著促进胶乳HbWRKY27基因上调表达。转录因子HbWRKY27可能在割胶和乙烯等调控橡胶树胶乳代谢中发挥重要作用,并且还可能与橡胶树死皮病的发生相关。     

死皮康复营养剂促使橡胶树死皮恢复过程中胶乳生理参数的变化

为探究橡胶树死皮恢复的生理基础,本研究采用死皮康复营养剂创制死皮不同恢复程度的实验材料,分析了健康、死皮和死皮不同恢复程度植株间胶乳干胶含量、总固形物含量、pH、黄色体破裂指数、硫醇含量、无机磷含量、蔗糖含量和转化酶活性等生理参数的变化规律。结果表明：橡胶树发生死皮后,胶乳产量、无机磷含量、硫醇含量和转化酶活性显著降低,而干胶含量、总固形物含量、pH、黄色体破裂指数和蔗糖含量显著升高。死皮康复营养剂处理能促使死皮橡胶树的恢复,具有一定的防治效果,其促使死皮恢复过程中,干胶含量、总固形物含量、黄色体破裂指数和蔗糖含量逐步降低,无机磷含量、硫醇含量和转化酶活性逐渐增加,胶乳产量回升,而pH变化不明显。由此可见,胶乳生理参数的异常与死皮发生密切相关,死皮恢复过程中,干胶含量、总固形物含量、黄色体破裂指数、硫醇含量、无机磷含量、蔗糖含量和转化酶活性等胶乳生理参数趋向于正常水平,调节这些胶乳生理参数向正常水平转变将有助于橡胶树死皮的恢复。研究结果为研发高效死皮防治药剂提供了理论基础。     

巴西橡胶树胶乳DNA的提取及特性分析

利用改良的SDS-醋酸钾沉淀法可以有效分离纯化胶乳DNA。胶乳经过高速离心后分为3层,上层主要是橡胶粒子,中间层是胶乳的可溶性胞质成分即C-乳清,下层主要是黄色体。分别对这3层组份进行DNA提取分析,结果显示胶乳DNA主要存在于黄色体层。限制性内切酶分析表明所得胶乳DNA是序列不均一的DNA分子。胶乳DNA主要由线粒体DNA和少量细胞核DNA组成。健康树中胶乳DNA含量要大于死皮树胶乳DNA含量。     

干旱胁迫下橡胶树叶片差异表达蛋白的鉴定与功能解析

干旱是影响橡胶树生长和产胶的重要非生物胁迫.以橡胶树无性系热研7-33-97为试验材料,通过干旱胁迫处理后,提取并纯化样品叶片的总蛋白质,经双向凝胶电泳(2-DE)和胶图分析.结果表明,干旱胁迫与对照样品相比,干旱胁迫10 d和15 d的橡胶树叶片蛋白中共存在38个差异表达蛋白点.采用MALDI-TOF MS分析和数据库检索,对差异表达的蛋白进行鉴定和功能注释,依照功能分类,这些蛋白主要参与胁迫应激响应、能量代谢、光合作用、信号转导以及细胞定位等生物学过程.     

热研88-13胶乳中乙烯释放量GC测定方法及其变化

探讨采用毛细管柱气相色谱法测定橡胶树胶乳中乙烯释放量的方法,并初步测定了首次割胶的胶乳中乙烯释放量和乙烯刺激割胶不同割次的乙烯释放量。试验用岛津GC2010型气相色谱仪,采用外标法,以保留时间定性,以峰面积定量,胶乳中乙烯释放量测定结果相对标准偏差（RSD）为1.08%,检出限为0.03μL·L^-1。用气相色谱法测定橡胶树中胶乳的乙烯含量和生成速率有简便、快速、高效、准确、灵敏度高等优点。橡胶树采用乙烯利刺激（S/2d/2＋3.0%ET）,在涂药后第1-5割次的胶乳乙烯释放量分别为：18.62、9.86、3.40、4.90、3.65μL·L^-1,而橡胶树首次割胶（对照）的胶乳中乙烯释放量为2.36μL·L^-1;第1-5割次的胶乳乙烯生成速率分别为：2.83、1.53、0.50、0.67、0.54nL·g^-1·h^-1,而对照的为0.36nL·g^-1·h^-1。结果表明：经乙烯利刺激后,橡胶树胶乳中乙烯释放量和生产速率均呈双峰型变化趋势,其中涂药后第1割次的胶乳中乙烯释放量最高;橡胶树胶乳中乙烯释放量与乙烯生成速率呈极显著正相关,r=0.9997^＊＊。     

巴西橡胶芽接树砧穗互作的蛋白质组初步研究

运用蛋白质组学研究技术,寻找砧木和接穗互作相关蛋白。以巴西橡胶树3种芽接组合植株的砧木与接穗结合部附近处的胶乳为试验材料,经双向凝胶电泳(2-DE)分离获得胶乳中存在的差异表达蛋白,采用质谱技术鉴定出32个差异表达蛋白,这些蛋白主要参与转录、翻译、光合作用、细胞分裂、蛋白质合成和胶乳合成等生物学过程。     

橡胶树胶乳全蛋白的提取及双向电泳分析

以橡胶树无性系RRIM600为材料，采用TCA(三氯乙酸)-丙酮沉淀法提取胶乳全蛋白，17 cm pH 5～8固相pH梯度预制干胶条和快速银染法对提取的蛋白进行分离和染色，所得到的电泳图谱背景清晰，横条纹和竖条纹少，且蛋白点数量多。通过本研究获得了高分辨率的胶乳全蛋白双向电泳(2-DE)图谱的方法，为进一步开展橡胶树胶乳全蛋白质组学研究奠定了基础。     

橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

COP9信号小体（CSN）是进化上保守的蛋白复合体,在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器,是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控,但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列,根据与拟南芥的相似性,分别命名为HbCSN1~HbCSN8。荧光定量PCR结果显示,8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达,其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高,其他成员在叶片中的表达量最高。而且,部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此,推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。