象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因的克隆及其RNAi 效应分析

 从象耳豆根结线虫中首次克隆了果胶酸裂解酶基因Me-pel-1,该基因cDNA 的开放阅读框(ORF)长813 bp,编码270 个氨基酸,具有果胶酸裂解酶第3 家族的4 个保守域特征。ME-PEL-1 与南方根结线虫的果胶酸裂解酶MI-PEL-1 和爪哇根结线虫的果胶酸裂解酶MJ-PEL-1 相似性最高,且系统进化树显示ME-PEL-1 也与它们最为接近。利用RNAi 技术对象耳豆根结线虫2 龄幼虫的Me-pel-1 进行沉默,结果发现Me-pel-1 基因被干扰后,象耳豆根结线虫2 龄幼虫对番茄的侵染率显著降低。该结果表明Me-pel-1 基因在象耳豆根结线虫侵染寄主的过程中发挥重要作用。     

南方根结线虫促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因的RNAi效应分析

 促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)在线虫的生长发育等方面具有重要作用,本研究探索利用RNAi技术沉默南方根结线虫mapk-1基因来抑制线虫的生长发育。根据mapk-1基因的cDNA序列设计引物,通过体外转录合成约550bp的dsRNA对南方根结线虫的卵进行RNAi以沉默mapk-1基因。试验结果表明,将南方根结线虫的卵块浸泡在含有2mg/mL dsRNA的M9缓冲溶液中,24h后卵块孵化出的2龄幼虫数量明显多于对照组(无dsRNA),但孵化出的幼虫死亡率高达90%,而对照组的死亡率低于5%,说明mapk-1基因的沉默抑制了卵块的孵化和线虫的生长,同时将孵化的幼虫接种番茄,14d后番茄根部无根结产生,35d后无卵块产生;而浸泡72h后卵块孵化出的2龄幼虫几乎全部死亡,并且孵化的线虫数量明显少于对照。提取导入dsRNA的卵块的RNA进行半定量PCR分析,结果表明mapk-1基因的mRNA被降解。     

辣椒CaRKNIF2基因的诱导表达特征及RNAi效应分析

[目的]明确在多种植物病原物和植物激素处理下,辣椒CaRKNIF2基因的诱导表达特性,分析CaRKNIF2基因的抗根结线虫功能.[方法]以辣椒‘HDA149’为试材,分别接种南方根结线虫毒性群体、烟草花叶病毒(TMV)、辣椒青枯病菌、辣椒疫霉病菌以及信号分子水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA),实时荧光定量PCR分析了辣椒CaRKNIF2基因的诱导表达模式和特征;构建了含CaRKNIF2基因片段的RNAi载体,通过烟草脆裂病毒介导的基因沉默(VIGS)同源沉默辣椒CaRKNIF2基因,来评价CaRKNIF2基因沉默的辣椒植株对线虫侵染的应答效应.[结果]信号分子MeJA抑制CaRKNIF2的表达,但TMV、辣椒青枯病菌、辣椒疫霉病菌以及信号分子水杨酸(SA)能快速而显著地诱导CaRKNIF2的表达,而毒性南方根结线虫对CaRKNIF2的表达则基本无影响;CaRKNIF2基因沉默的辣椒植株接种非毒性南方根结线虫后根部卵块数明显增加.[结论]这些结果为进一步解析CaRKNIF2的调控功能提供了重要的证据.     

爪哇根结线虫Mj-1-1基因的克隆、鉴定及RNAi表型分析

根据爪哇根结线虫食道腺内表达的EST序列,结合反式剪接序列SL1,从爪哇根结线虫中克隆了一个假定寄生基因Mj-1-1(KU358725),该基因的c DNA全长为573 bp,包含450 bp的开放阅读框(ORF),编码149个氨基酸。DNA全长为740 bp,包含2个内含子,长度分别为20 bp和111 bp。NCBI BLASTn比对表明,Mj-1-1与南方根结线虫的M.incognita zk1236.5(JQ284068)基因相似性最高,为97%。原位杂交表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫的背食道腺中表达,qRT-PCR结果表明Mj-1-1基因在爪哇根结线虫寄生性3龄幼虫阶段表达量最高。对爪哇根结线虫侵染前2龄幼虫的Mj-1-1基因进行沉默,调查发现,沉默Mj-1-1后,爪哇根结线虫对番茄的侵染力显著下降,表明Mj-1-1对爪哇根结线虫侵染和寄生具有重要的调控作用。     

南方根结线虫生防菌YB-1503菌株鉴定及作用机理研究

南方根结线虫是一种全球性的植物寄生线虫,严重时会导致植株生长不良甚至死亡。为了挖掘南方根结线虫病的高效生防菌株,利用平板稀释法从严重发生根结线虫病的番茄根结中分离出24株细菌,并根据不同菌株的培养液对南方根结线虫的致死活性及其盆栽防治效果筛选生防菌。结果显示菌株YB-1503培养液对根结线虫的二龄幼虫校正死亡率最高,处理48 h时达70.0%,对番茄根结线虫病盆栽防治效果最好,为65.8%,同时促进番茄植株的生长。通过形态学、生理生化特征和分子生物学方法将菌株YB-1503鉴定为坚强芽胞杆菌Bacillusfirmus。此外,菌株YB-1503发酵滤液能够显著降低南方根结线虫的过氧化氢酶、羧酸脂酶和乙酰胆碱脂酶的活性,并降低线虫的抗氧化能力,增加线虫活性氧含量,从而导致线虫死亡。由此可见,菌株YB-1503具有较大的开发利用潜力。     

活性氧与木质素对细菌Sneb825诱导番茄抵抗南方根结线虫侵染的响应

 根结线虫病严重威胁各类蔬菜作物的生产,是世界上最难防治的土传病害之一。利用生防细菌能够有效地控制蔬菜根结线虫种群数量并降低危害。荧光假单胞菌Sneb825是本实验室筛选出的对南方根结线虫病具有较高防效的生防细菌。本研究通过盆栽试验、裂根试验和温室试验验证了荧光假单胞菌Sneb825诱导番茄抗南方根结线虫侵染的防治效果;通过酶联免疫法(ELISA)和实时荧光定量PCR检测了番茄根系内活性氧与木质素含量及其相关基因表达量的变化。研究发现,Sneb825菌株发酵液不但能够有效降低南方根结线虫对番茄的侵染,而且对番茄植株有显著的促生作用。Sneb825菌株发酵液灌根处理并接种南方根结线虫二龄幼虫后,番茄根系内活性氧(10 dpi)和木质素含量(5 dpi)显著高于空白对照;活性氧合成相关基因RBOH1(10 dpi)和过氧化物酶基因Ep5C(10 dpi)以及木质素合成相关基因Tpx1(5 dpi)的表达量均达到最高值。研究结果表明活性氧和木质素的大量积累是荧光假单胞菌Sneb825诱导番茄抑制南方根结线虫侵染的防御对策之一。荧光假单胞菌可以有效的防治根结线虫病,在农业生产实践中具有潜在的应用前景。     

PGPR对番茄南方根结线虫病的影响

于温室盆栽条件下初步研究了4种根围促生细菌（PGPR）对番茄植株生长和南方根结线虫Meloidogyne incognit病发生情况的影响。结果表明接种多粘芽孢杆菌Bacillus polymyxa或芽孢杆菌菌株B697的番茄植株高度、地上部和地下部干重均显著大于对照,而巨大芽孢杆菌B. megaterium和固氮螺菌Azospirillum sp.菌株A135无促生作用。接种多粘芽孢杆菌＋南方根结线虫和B697菌株＋南方根结线虫两处理的二龄幼虫数、雌虫数、线虫总数、根上卵囊数、卵囊含卵量、发病率和病情指数显著低于只接种南方根结线虫的对照。多粘芽孢杆菌、B697菌株、巨大芽孢杆菌和A135菌株对南方根结线虫的防效分别达65.4%、68.2%、53.8%和53.8%。     

寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因TlChi46的克隆

为进一步筛选高效寄生线虫真菌和阐明其寄生线虫卵的机理,本研究从湖北省烟草南方根结线虫雌虫分离到1株具高效生防潜力的菌株HBF1。形态学、rDNA-ITS和翻译延长因子tef1-α序列分析鉴定该菌为长梗木霉菌Trichoderma longibrachiatum,其对南方根结线虫卵第10 d寄生率为80.45%。通过简并引物设计和RACE技术克隆其几丁质酶基因,分析该基因序列及与其他几丁质酶的同源性。该菌是1株可以产生几丁质酶的南方根结线虫卵寄生真菌,第10 d几丁质酶的活性达到高峰,为24.88μmol/h/mL。本研究首次从长梗木霉HBF1菌株中克隆到1个几丁质酶基因TlChi46,该基因DNA全长1 793 bp,含3个内含子和1个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸,理论分子量45.9 kDa,等电点5.23。同源性比对表明和昆虫寄生菌几丁质酶的亲缘关系较远。从长梗木霉HBF1中克隆得到的几丁质酶基因编码的几丁质酶的功能域可供进一步研究,高效产几丁质酶并有效寄生南方根结线虫卵的长梗木霉对南方根结线虫具有良好的生防潜力。     

南方根结线虫中国分离群体种内变异分析

为调查我国不同地区和不同寄主上的根结线虫Meloidogyne spp.种类分布以及群体变异情况,基于酯酶和苹果酸脱氢酶同工酶图谱及SCAR分子标记技术对2017—2019年从6省19种植物根部组织分离到的40个根结线虫群体进行鉴定,针对南方根结线虫M. incognita群体分别通过寄主鉴别法进行生理小种鉴别,利用携带Mi抗性基因的番茄进行毒力测试,对2龄幼虫的口针长度和体长进行测量,并对核糖体ITS和线粒体Nad5基因序列进行比较分析。结果显示:根结线虫分离群体经鉴定包括38个南方根结线虫群体和2个象耳豆根结线虫M. erterolobii群体;38个南方根结线虫群体中有35个群体被鉴别为1号生理小种,其余3个群体被鉴别为2号生理小种;发现1个南方根结线虫群体CN19可在携带Mi抗性基因的番茄上侵染繁殖,为毒性群体,其余群体无法进行侵染和繁殖,为无毒群体。南方根结线虫群体2龄幼虫的口针长度和体长均差异较大,而不同寄主来源分离群体的ITS和Nad5基因序列也存在一定变异。基于ITS和Nad5基因序列构建的系统发育树将所有根结线虫群体归为南方根结线虫和象耳豆根结线虫组成的2个独立分支,...     

假格里尼翁苍白杆菌A-29对南方根结线虫的防治效果及其鉴定

南方根结线虫是一种重要的植物寄生线虫,严重发生时可造成巨大的经济损失。本研究测定了菌株A-29发酵液对南方根结线虫的致死效果和盆栽防效,并对其进行了种类鉴定。结果表明,菌株A-29发酵滤液原液、5倍液和10倍液处理南方根结线虫后,2龄幼虫的致死率在24 h和48 h后达71.09%～95.45%,卵的孵化抑制率4 d时为59.25%～87.86%,其死亡率随处理浓度的提高而增加;菌株A-29发酵液处理60 d后对番茄根结线虫的防治效果达75.00%,番茄植株鲜重、根系干重和植株高度分别增加38.41%、33.52%和20.01%;根据菌株A-29的形态特征、生理生化特征、16S rRNA基因序列及其系统发育关系,将其鉴定为假格里尼翁苍白杆菌Ochrobactrumpseudogrignonense。研究表明,菌株A-29不仅对南方根结线虫具有良好的致死效果,而且对番茄植株具有明显的促生作用,是一株具有应用前景的生防菌。     

南方根结线虫伴生细菌宏基因组fosmid文库构建及其特征分析

为了研究南方根结线虫与伴生细菌的互作及其伴生细菌多样性,采用碘海醇介质离心技术、SDS裂解法和酚/氯仿抽提法等构建了南方根结线虫Meloidogyne incognita伴生细菌宏基因组fosmid文库,并进行文库特征分析.结果表明,该文库包含3万个克隆,插入片段大小分布在30～45kb之间,平均长度为40kb左右;共计包含1171 Mb DNA;质粒在fosmid传代中稳定遗传,没有发现插入片段的丢失或重排.末端测序结果显示,文库中南方根结线虫序列占2.04%,细菌序列占44.90%,无同源序列占53.06%;南方根结线虫伴生细菌优势种群为Sphingopyxis属和代尔夫特菌属Delftia.     

Molecular cloning and virus-induced gene silencing of MiASB in the southern root-knot nematode, Meloidogyne incognita

Root-knot nematodes (Meloidogyne spp.), cause serious damage to agricultural production worldwide. In this study, we designed special primers based on the predicted Mitochondrial ATP synthase b subunit gene (ASB) sequence to clone the same gene in M. incognita (MiASB). The identity between the cloned MiASB and the predicted MiASB was as high as 100 %. Using the tobacco rattle virus (TRV)-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) system, we delivered MiASB RNAi triggers to the M. incognita feeding site on tomato seedlings, resulting in significantly fewer galls on the seedlings. Sixty days after inoculation with M. incognita, the number of root galls induced on the MiASB silence-treated seedlings was reduced by 64.3 % compared to that on the control seedlings, and reduced by 64.1 % compared to that on untreated control seedlings. This study revealed the MiASB silencing had a positive effect on the control of root-knot nematodes, and MiASB may be associated with the formation of galls caused by the nematode.     

水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗体制备

为探讨水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）的种群变异,采用RT-PCR方法从感染RBSDV山东分离物RBSDV-JN1的水稻中克隆该病毒的S10片段,并进行序列分析,进而构建包含RBSDV-JN1的CP基因的原核表达载体,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）诱导表达;并以表达的融合蛋白为抗原,制备病毒的多克隆抗体。结果显示：S10片段全长为1 801 bp,包含1个1 677 bp编码框,编码558个氨基酸的外壳蛋白（CP）;与GenBank已注册的19个RBSDV的CP基因序列相比较发现,病毒各分离物间核苷酸的序列相似性为90.5%~99.8%,氨基酸的序列相似性为95.9%~100.0%;地理位置较近的分离物间序列相似性较高,RBSDV种群分布呈现区域性差异。原核表达载体pET-RBSDV-CP经IPTG诱导,获得了分子量约为63 kD带有His标签的目的蛋白。用该蛋白制备的多克隆抗体经ELISA、Western blot和Dot-blot ELISA检测显示,效价为1：81 000,且具有良好的特异性。     

黄瓜幼苗内生真菌诱导植株对南方根结线虫的抗性

在2007-2008年的一项温室测验中,10株黄瓜幼苗内生真菌表现出了对南方根结线虫较好的防效,为了阐明其作用方式,用裂根试验设计研究了10个菌株诱导黄瓜产生根结线虫抗性的能力.同一植株的根系被分为彼此隔离的挑战根系和应答根系,镰刀菌Fusarium spp.菌株Fu234和Fu654、毛壳菌Chaetomium sp.菌株Ch1001、叶点霉Phyllosticta sp.菌株Ph511在挑战根系中接种后,应答根系中的线虫入侵总数显著降低,较对照分别降低了42.4％、35.7％、38.4％、23.6％(第1次测定)和63.6％、45.2％、51.0％、37.0％(重复测定),这4个菌株诱导了黄瓜对根结线虫入侵的抗性.同时,Fu234、Fu654、Ch1001和拟青霉Paecilomyces sp.菌株Pa972接种后应答根系中的卵与雌虫的比值显著减少,相比对照其比值分别降低了24.3％、37.7％、48.3％、21.2％(第1次测定)和21.6％、39.8％、30.0％、46.2％(重复测定),这4个菌株诱导了黄瓜对根结线虫繁殖的抗性.     

茄子砧木根系苯丙烷类代谢与抗南方根结线虫水平的关系

采用盆栽幼苗人工接种方法,研究南方根结线虫侵染对茄子砧木幼苗根系苯丙氨酸解氨酶(PAL)、酪氨酸解氨酶(TAL)及多酚氧化酶(PPO)活性和总酚、木质素含量的影响.结果表明,无论是否遭受南方根结线虫侵染,幼苗根系PAL、TAL、PPO活性及总酚、木质素含量均以托鲁巴姆显著高于赤茄.虽然南方根结线虫侵染使2个茄子砧木幼苗根系苯丙烷类物质含量及相关酶活性均有所增加,但以托鲁巴姆增幅较大,其PAL、TAL、PPO活性及总酚、木质素含量的最大增幅较对照分别高67.87%、82.13%、32.19%、62.14%和20.91%,而赤茄仅分别较对照高47.13%、45.52%、18.08%、35.38%、14.86%.整个侵染进程中,托鲁巴姆始终表现出强烈的抗性反应,而赤茄除在初次侵染前期表现出一定的抗性反应外,其余时间反应较弱,尤其在遭受二次侵染时,抗性反应显著低于初次侵染.表明苯丙烷类代谢产物及关键酶与茄子砧木抗南方根结线虫水平密切相关.     

A plant-specific tau class glutathione S-transferase from Oryza sativa with very high activity against 1-chloro-2,4-dinitrobenzene and chloroacetanilide herbicides

A plant-specific tau class GST gene homolog was successfully cloned from an Oryza sativa cDNA library by PCR using oligonucleotide primers based on the OsGSTU4 (GenBank Accession No. AF309378) sequence. The cDNA was composed of a 720-bp open reading frame encoding 239 amino acids. The deduced amino acid sequence of this gene shared over 65% sequence identity with the sequences of the tau class TaGST28e45 and ZmGST42. Conversely, the OsGSTU4 sequence showed very low identity to the GST sequences of phi, theta and zeta classes. This gene was expressed in Escherichia coli with the pET vector system, and the gene product was purified to homogeneity using GSH-Sepharose affinity column chromatography. The expressed OsGSTU4 formed a homodimer with subunits of approximately 25.5 kDa. OsGSTU4 displayed very high activity toward 1-chloro-2,4-dinitrobenzene. The activity of the OsGSTU4 was significantly inhibited by S-hexylglutathione and hematin. Plant OsGSTU4 had a unique herbicide specificity and played an important role in the detoxification reaction against fluorodifen and chloroacetanilide herbicides.     

四种熏蒸剂对辣椒疫霉和南方根结线虫的毒力

为明确不同熏蒸剂对土传病原菌辣椒疫霉Phytophthora capsici和南方根结线虫Meloidogyne incognita的毒力,采用密闭熏蒸法测定了4种土壤熏蒸剂氯化苦、棉隆、威百亩、1,3-二氯丙烯的毒力及1,3-二氯丙烯和氯化苦复配的联合毒力。结果表明:氯化苦、棉隆、威百亩、1,3-二氯丙烯对辣椒疫霉的EC₅₀分别为0.12、2.44、8.30、8.45 mg/L; 对南方根结线虫的EC₅₀ 分别为1.23、0.22、0.30、0.18 mg/L。1,3-二氯丙烯和氯化苦以2:1、1:1、1:2比例复配时对辣椒疫霉的EC₅₀ 分别为1.13、0.24、0.14 mg/L;对南方根结线虫的EC₅₀分别为0.19、0.32、0.61 mg/L。结合经济效益和多种病害兼治的原则,推荐使用1,3-二氯丙烯与氯化苦1:1配比,可兼治辣椒疫病和根结线虫病。     

Cloning of a rice tau class GST isozyme and characterization of its substrate specificity

The GST cDNA was successfully cloned from an Oryza sativa cDNA library by PCR using oligonucleotide primers based on the OsGSTU5 (GenBank Accession No. AF309377) sequence. The cDNA was composed of a 687-bp open reading frame encoding for 228 amino acids. The deduced amino acid sequence of this gene shared over 60% sequence identity with the sequences of the tau class ZmGSTU6 and ZmGSTU19. This gene was expressed in Escherichia coli with the pET vector system and the gene product was purified to homogeneity by GSH-Sepharose affinity column chromatography. The expressed OsGSTU5 formed a homo-dimer composed of 25 kDa subunit and its pI value was approximately 7.5. The OsGSTU5 displays high activities towards 1-chloro-2,4-dinitrobenzene and 1,2-epoxy-3-(p-nitrophenoxy)propane. The activity of the OsGSTU5 was significantly inhibited by hematin and ethacrynic acid. The OsGSTU5 shows the highest activity towards chloro-s-triazine and acetanilide herbicides.