枣疯病和泡桐丛枝病原植原体分离物的组织培养保藏和嫁接传染研究

分别从河北唐县赞皇大枣、辽宁凌源梨枣和河南濮阳扁核酸3个品种的枣疯病和来自山东、江西和北京的不同无性系的泡桐丛枝病树上采集丛枝枝条作为组织培养材料,获得的枣疯病和泡桐丛枝病组培苗皆表现典型的丛枝症状。其中感染植原体的赞皇大枣组培苗(Ft)和扁核酸组培苗(HPD)在未加任何激素的MS培养基和其它培养基交替继代培养1a以上仍能维持丛枝苗生长;而发病梨枣(LD)除产生丛枝外,还出现叶片黄化和植株矮化、枯梢等衰退症状。泡桐丛枝病植原体可在不同无性系组培苗上通过各种培养基交替和单纯的MS培养基继代培养,并已在实验室内连续保藏达10a,其引致丛枝症状的能力无明显的改变。用枣树Ft染病材料作接穗,以健康冬枣(DJ)和抗病婆枣(W14)砧木进行组培苗间嫁接传病试验,可使部分DJ和W14发病;而嫁接未发病的砧木多数像健苗一样正常生长。用感染山东泡桐丛枝病植原体ZD株系丛枝组培苗为接穗,嫁接健康泡桐无性系组培苗致使无性系MB33、TY2T和C125发病。用植原体16SrDNA通用引物进行PCR,确证了泡桐和枣树发病苗和嫁接发病组培苗体内存在植原体。用DAPI荧光显微镜技术比较组培苗韧皮部筛管中的植原体浓度,结果显示,Ft和嫁接发病冬枣(DJ-Ft)筛管中植原体浓度相对较高,但仍低于各泡桐无性系染病丛枝组培苗;HPD和LD浓度中等,而发病的W14砧木含有植原体的筛管数量较少、且浓度很低。在嫁接不成功或未发病的DJ和W14砧木组织及健康对照组织中皆检测不到植原体荧光。     

无植物菌原体泡桐苗防治丛枝病效果初析

将经脱毒处理和未经脱毒处理但经病原检测确证无植物菌原体感染的泡桐组培苗，进行扩大繁殖，温室驯化，然后分别在不同地区的苗圃地和造林地定植，每年定期调查泡桐丛枝病的发生情况。试验结果显示，脱毒苗和无毒苗无论在重病区、中度病区还是在轻病区，三年内发病率都大大低于常规种根育苗对照，其中在各地区种植的全部脱毒苗三年内发病率皆为零。证明用无毒苗是解决泡桐苗期和幼树期丛枝病为害的有效措施。     

无植物菌原体泡桐苗防治丛枝病效果初析

将经脱毒处理和未经脱毒处理但经病原检测确证无植物菌原体感染的泡桐组培苗，进行扩大繁殖、温室驯化，然后分别在不同地区的苗圃地和造林地定植，每年定期调查泡桐丛枝病的发生情况。试验结果显示，脱毒苗和无毒苗无论在重病区、中度病区还是在轻病区，三年内发病率都大大低于常规种根育苗对照，其中在各地区种植的全部脱毒苗三年内发病率皆为零。证明用无毒苗是解决泡桐苗期和幼树期丛枝病为害的有效措施     

根癌农杆菌对感染植原体的泡桐组培苗症状的影响

采用含有激素合成相关基因的根癌农杆菌，伤口接种已感染植原体的泡桐丛植组培苗和健康组培苗，结果发现对丛植苗的致瘤能力明显低于健康对照苗，且被接种病苗的丛枝症状缓解，从健苗获得的T-DNA转化泡桐瘤组织细胞能在无激素培养基上稳定生长和连续继代培养2年以上，说明瘤组织细胞自身已获得了细胞分裂素和生长素合成能力，根据已报道的根癌农杆菌株系pTil5955T-DNA的异戊烯基转移酶基因（ipt)的保守序列，设计了一对引物（CYT和CYT′），用多聚酶链式反应（PCR）扩增了我国杨树致瘤农杆菌ipt基因部分序列（427bp片段），也从遗传转化的两个泡桐无性系瘤组织At-ZH和At-T35扩增出此特异片估，从而进一步肯定了T-DNA已被整合到泡桐的染色体上表明泡桐易于通过Ti质粒载体途径进行基因转移操作，但用此引物未能从泡桐、甘薯健株和感染植原体的组培病苗扩增出相应的427bp特异片段，当用此遗传转化瘤组织嫁接病苗时，可减轻从枝症状的严重度，延长病苗的存活时间和诱导病株生根，这进一步证实了泡桐在与植原体相互作用过程中激素代谢发生了变化。     

以tuf基因为靶标的5种16SrⅠ组植原体环介导恒温扩增技术

【目的】建立一种能够特异性检测和鉴定16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,实现16SrⅠ组植原体的快速检测。【方法】以植原体tuf基因作为靶标,通过序列比对,设计多组具有特异性的LAMP引物组,筛选出一套适用于16SrⅠ组植原体的特异性检测体系。以16SrⅡ组、16SrⅤ组、16SrⅩⅨ组植原体样品按照此检测体系进行反应,来验证其特异性;同时将稀释后的感病组织样品同步进行PCR和LAMP检测,以确定其检测灵敏度。对来自不同省市的6份田间样品以及9份组培样品进行检测,以验证其检测的稳定性。【结果】16SrⅠ-LAMP在恒温63℃条件下40 min内完成扩增,能检测5种分别引起泡桐丛枝、苦楝丛枝、桑树萎缩、莴苣黄化和长春花绿变病的16SrⅠ组植原体,不能检测其他组植原体包括16SrⅡ组的花生丛枝、甘薯丛枝、臭矢菜丛枝、16SrⅤ组的枣疯病、红花槐丛枝、樱桃致死黄化和16SrⅩⅨ组的板栗黄化皱缩植原体。通过在反应液中加入钙黄绿素肉眼判断绿色为阳性结果,褐色为阴性结果,与用荧光定量设备进行判读扩增曲线的结果一致。相比于PCR检测,16SrⅠ-LAMP检测的灵敏度提高了8倍;16SrⅠ-LAMP能够快速检测出来自不同区域的田间泡桐发病样品、感病泡桐组培苗和嫁接传病脱毒苗。【结论】以tuf基因作为靶标,建立能同时检测5种16SrⅠ组植原体的环介导恒温扩增技术,具有高效、特异、操作简便、检测时间短及成本较低等优点,适合于基层和现场检测。     

丛枝病植原体侵染对泡桐组培苗组织内H2O2产生的影响

用保存的不同泡桐无性系染病和健康组培苗为试材,对染病苗、机械损伤、嫁接接种和健康组培苗组织中H2O2及过氧化物酶的变化进行研究.用DAB组织染色方法对H2O2组织定位结果显示,在未损伤情况下多数染病泡桐苗和健康苗H2O2积累皆较少.机械损伤后,病与健苗皆出现H2O2过量积累,其中健苗强于病苗.在维管束部位,重症苗POD活性最强,轻症苗次之,无症和健康苗活性较低;而且所有苗在脉间叶肉组织POD活性都明显低于叶脉组织.用病接穗嫁接健康泡桐砧木的早期(3天以内)似乎与损伤反应类似(包括POD和H2O2产生);6天后损伤反应减弱.嫁接接种成功的组合至20天,在嫁接接口处仍维持高的H2O2释放和强POD活性,并且砧木主茎和部分叶片出现系统性POD活性增强和H2O2积累.采用KI/淀粉试剂对H2O2组织定位结果显示:在健株主茎切片中皮层和髓细胞表面、木质部成熟导管管壁有较强的H2O2释放;而病株的相应部位产生量较少.在健康切片测定液中加入病主茎横切片可诱导健康切片H2O2积累量增加.用不同浓度的H2O2处理染病泡桐丛枝茎段外植体1 h,在25～100 mmol·L-1浓度范围内能明显缓解组培苗丛枝症状.抗坏血酸和低通气环境处理也有减轻病苗丛枝症状的作用.不同泡桐品系在活性氧代谢上的差异与其对植原体的抗性存在密切关系.     

羽脉山黄麻丛枝植原体的分子鉴定及病害调查

【目的】了解羽脉山黄麻丛枝病在云南省玉溪市新平县的发生情况和危害程度,通过分子生物学方法确定病原物及其分类地位,为本地区植原体防控提供参考。【方法】利用普查法获得病害发病率,评估病害危害程度。利用植原体通用引物P1/P7及R16F2n/R16R2对感病植株总DNA进行巢式PCR扩增、克隆和测序,得到16S r DNA序列。再用植原体在线分类鉴定工具i PhyClassifier以及MegaX软件分别进行序列分析和构建基于16S r DNA序列的系统进化树,确定病害病原物及其分类地位,通过在线分析软件MUSCLE比较相关序列的同源性。【结果】根据调查发现羽脉山黄麻丛枝病发生于大约101°35'—101°53'E和23°56'—24°20'N之间,主要是在低海拔400～600 m温度相对较高的干热河谷地区,说明高温有利于植原体病害的发生。该处连续3年发生此病害,2018年7月调查得知其平均发病率为38.9%,属中度危害。PCR扩增获得约1 246 bp的羽脉山黄麻丛枝病植原体16S r DNA序列(株系:TLWBYN01,登录号:MN513329)。分析表明TLWBYN01与翠菊黄化植原体(Candidatus Phytoplasma asteris)的参考菌株(M30790)相似度为99.8%,因此该植原体为‘Candidatus Phytoplasma asteris’相关菌株,属于16S r I组成员。TLWBYN01的F2nR2片段虚拟RFLP模型与16S r I-X亚组的参考模型番木瓜束顶植原体(登录号:JF781308)最为相似,相似系数为0.98,17种限制性内切酶的酶切图谱显示与16S r I-X参考株只有MseI不同,因此该植原体属于16S r I-X亚组的变种。比较得出TLWBYN01与16S r I-X亚组成员番木瓜束顶植原体(JF781308)和印度葫芦植原体(LT594117、LT594118)同源性分别为99.2%和99.6%。【结论】玉溪市新平县发现的羽脉山黄麻丛枝病属局部常发病害,中度危害,但一旦感染,就会严重影响植物生长。羽脉山黄麻丛枝植原体属16 Sr I组成员,也是报道较少的植原体16S r I-X亚组的一个变种,且羽脉山黄麻为新发现的植原体新寄主。     

泡桐丛枝病发生特异相关蛋白质亚细胞定位及质谱鉴定

借助胶体金免疫电镜和质谱分析技术,利用制备的专化性抗体,进行豫杂一号泡桐丛枝病发生特异相关蛋白质(m 24 ku,pI 6.8)叶片和茎尖的亚细胞定位和质谱鉴定研究.结果显示:豫杂一号泡桐丛枝病发生特异相关蛋白质分布于健康苗叶片和茎尖细胞的细胞壁、液泡和叶绿体部位,患病幼苗叶片和茎尖细胞相同亚细胞器部位未发现该蛋白质的存在,进一步表明植原体侵染阻断了此蛋白的合成.此外,基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)分析该特异蛋白后,通过查询MSDB数据库初步断定该特异相关蛋白为水稻叶绿体分子伴侣Q6K822-ORYSA的同源蛋白.     

5-氮胞苷和利福平对丛枝病泡桐幼苗形态和蛋白质变化的协同影响

以感染丛枝病的豫杂一号泡桐幼苗为试验材料,通过不同浓度5-氮胞苷和利福平处理,研究了其幼苗形态和蛋白质的变化。结果表明,适宜浓度的利福平和5-氮胞苷共同使用可抑制泡桐丛枝病的发生。150μmol·L-15-氮胞苷+80 mg·L-1利福平可以抑制豫杂一号泡桐丛枝病症状。存在于健康豫杂一号幼苗中的蛋白质pI 6.8、m24ku而在病苗中观察不到。表明该蛋白质可能与豫杂一号泡桐丛枝病发生有一定关系。     

高浓度6-BA诱导酸樱桃苗的玻璃化苗内源激素含量变化

研究了培养基中不同浓度6-BA对酸樱桃组培苗玻璃化率及内源激素含量的影响,利用酶联免疫吸附分析法测定正常苗与玻璃化苗愈伤组织和芽中IAA、GA3和ZR含量.结果表明:高浓度6-BA导致组培苗玻璃化,当培养基中6-BA浓度为0.5 mg·L-1时,组培苗未出现玻璃化苗;当培养基中6-BA浓度为3.0 mg·L-1时,组培苗玻璃化率高达95%.通过玻璃化苗和正常苗内源激素比较发现,玻璃化苗愈伤组织IAA和GA3含量明显高于正常苗愈伤组织中IAA和GA3含量,ZR含量基本相等;玻璃化苗芽中ZR含量远远低于正常苗中ZR含量,而IAA和GA3含量基本不变,高浓度6-BA导致组培苗内源激素比例失调发生玻璃化.     

泡桐丛枝病带毒苗过氧化物酶同工酶分析

用电镜鉴定泡桐丛枝病的带毒苗,用圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳分析病苗、带毒苗与健康苗之间的过氧化物酶同工酶酶谱的差异。结果表明,带毒苗与健康苗的酶谱无差异,都表现为9条酶带,病苗酶谱表现出10条酶带。     

多位点序列分析揭示我国16SrI组植原体不同株系间遗传变异和系统发育关系（英文）

【目的】16SrI组植原体对我国作物和生态植物危害严重。目前植原体尚不能分离培养,对于我国植原体不同株系间遗传变异和种群结构尚不清晰,通过多位点序列分析(MLSA)揭示我国不同地区16SrI组不同植原体株系的遗传多样性及其地理分布特征,比较不同植原体株系间不同持家基因的变异程度,为我国不同植原体株系的检测、分类鉴定和系统发育研究提供一定的参考方法和依据。【方法】应用rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB共10个持家基因序列,结合16S rDNA序列,以全基因序列已完成的洋葱黄化植原体(OY-M)、翠菊黄化丛枝植原体(AYWB)、澳大利亚葡萄黄化植原体(CPA)、草莓致死黄化植原体(SLY)和苹果簇生植原体(CPM)共5种植原体株系为参照,分析我国10个省(市)苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系(共18株)的遗传变异规律和系统发育关系,通过多重序列比对分析不同基因片段的序列多态性和变异程度。【结果】我国18株苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、泡桐丛枝和长春花绿变植原体株系的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB,pyrG和rpoB多位点序列共有15种序列类型,从而揭示16SrI组不同植原体株系间丰富的遗传多样性。基于rp等10个基因多位点序列分析可将16SrI-B、D亚组的不同植原体株系清晰地分开。10株苦楝丛枝植原体株系与2株桑萎缩植原体株系系统发育关系最近,多位点序列分析可将这2种基于16S rDNA序列难以区分的植原体株系清晰地区分。10株苦楝丛枝植原体株系分为4个进化枝,其多位点序列存在8种序列类型,这4个分枝与植原体株系的地理分布关系密切。与我国长春花绿变和泡桐丛枝植原体株系相比,福建三明2株莴苣黄化植原体株系与日本洋葱黄化植原体株系OY-M系统发育关系较近。在已检测分析的植原体不同基因序列片段中,dnaK基因序列片段的变异水平最高。【结论】多位点序列分析可做为一种对植原体鉴定、区分以及株系遗传多样性全面检测的有效、可靠方法。在以后的研究中该方法可广泛应用于深入探讨植原体不同组间或亚组间株系的遗传变异和系统发育关系。     

泡桐丛枝病感病指示植物的病理变化——Ⅰ.同工酶、酚及酚相关酶

以感染泡桐丛枝病类菌原体的长春花和健康长春花的叶片为材料,对其过氧化物酶、酯酶、谷草转氨酶、总酚及酚相关酶进行分析测定。结果表明,与健株相比较,病株中三种同工酶的活性降低了,某些酶带颜色变浅或消失:总酚含量与绿原酸含量有所增加:多酚氧化酶与苯丙转氨酶活性明显增强,并讨论了这些变化与类菌原体致病存在的可能关系。     

不同等级泡桐容器苗大田移栽后生长表现对比

【目的】泡桐轻基质容器苗的是利用泡桐良种脱毒组培苗移栽至轻基质容器中培育形成的苗木,在其工厂化培育过程中,由于培育水肥和光照微生境的异质性,使同批泡桐组培苗生长形成为生长势不同的轻基质容器苗,为明确不同等级泡桐轻基质容器苗移栽至大田后苗木间生长和质量的差异;【方法】在河南省通许县建立生长对比试验林,对泡桐轻基质容器苗壮苗和弱苗的大田移栽苗木的苗高、地径、根幅、根茎叶器官组织中全氮、全磷、全钾和有机碳浓度、单位面积产苗数和优质苗产出率进行了测定分析。【结果】1个生长季后,泡桐轻基质容器苗壮苗培育的大田苗苗高、地径、根幅和大田保存率为3.96m、5.77cm、1.34m和92.22%,分别比弱苗提高了40.43%、19.21%、103.03%和18.41%。方差分析表明,各生长指标均极显著高于弱苗培育的大田苗;泡桐壮苗培育的大田苗茎组织内各矿质元素浓度均高于弱苗大田苗,组织内全磷、全钾浓度分别为0.49 g·kg-1和2.56 g·kg-1,均极显著高于弱苗培育的大田苗;而壮苗根、叶组织中全氮、全磷、全钾和有机碳浓度与弱苗差异不显著;壮苗单位面积大苗产出数6403株·hm-2和优质苗产出率达58.24%,分别比弱苗提高了1.17倍和8.73倍。【结论】利用泡桐轻基质容器苗壮苗培育的大田苗的优质苗产出数、苗木质量均优于利用弱苗培育大田轻基质容器苗,应在生产中推广应用。     

泡桐根系应答铅锌矿胁迫的转录组分析

【目的】白花泡桐Paulownia fortunei (Seem.) Hemsl.为中国南方重要的尾矿造林树种。为了揭示泡桐根系受重金属胁迫后的转录调控机制,明确泡桐根系响应重金属胁迫的相关基因和重要通路。【方法】以生长在铅锌矿、南方红壤的白花泡桐根为实验材料,进行高通量测序,将组装的基因序列在Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、SwissProt、KEGG和GO数据库中进行基因功能注释,同时对在红壤、铅锌矿中差异表达的泡桐根部基因进行了分析。【结果】1)经过测序共得到366 701 960条reads序列,总碱基数为53.90 Gb,GC平均含量达44.58%。将测序所得reads再经Trinity软件组装后得到126 061条基因序列,其中96 133条序列获得了注释信息,占总数的76.25%。2)注释到Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-Prot、KEGG和GO数据库的基因序列数分别为63 938、64 685、68 840、29 886、66 433、28 747、68 840条。3)相对于红壤生长条件,铅锌矿胁迫时泡桐根部分别有154个基因上调和4 143个基因下调表达。4)差异表达基因的GO富集性分析发现,这些基因的功能主要集中于结合(Binding)、细胞器(Organelle)、细胞蛋白代谢(Cellular protein metabolic process)。将差异表达基因在KEGG数据库中比对发现,差异基因主要富集于核糖体、内质网蛋白加工、剪接体、胞吞作用、RNA转运、吞噬代谢、mRNA监测等7个代谢通路。其中,核糖体是最主要的代谢途径。q RT-PCR所检测的6个差异基因表达模式与RNA-seq结果保持一致,证实了RNA-seq结果的可靠性。【结论】本研究提供了泡桐根部在铅锌矿和红壤条件下的转录组信息,并分析了泡桐根部转录组变化情况,为寻找泡桐根部响应重金属胁迫的基因打好基础。     

泡桐炭疽病和楠木白绢病的防治

泡桐炭疽病泡桐炭疽病主要在实生苗上发生,也可侵染根蘖苗和大树上发生丛枝病的部分.病菌侵染嫩茎、叶柄、叶脉和叶片.茎和叶柄上的病斑呈椭圆形,直径1-2毫米到3-5毫米,病斑中央稍坳陷.雨天,病斑内产生粉红色分生孢子盘.叶片上的病斑近圆形,直径1毫米左右,黄褐色,常成穿孔状.发病严重时,病斑连成片,常引起嫩梢干缩枯死,俗称扭耳病.     

泡桐丛枝病的防治

泡桐丛枝病,俗名“毛瘿病”、“扫帚病”,病源为“类菌质体”,其防治办法有以下几种:1、选用抗病良种。如白花泡桐、毛泡桐、楸叶泡桐等,尤其在更换栽植时更要注意良种的选择。2、剪除病枝。一般在春季发芽初进行一次,秋分以后进行一次,以秋季进行为好。原因是可减少病源越冬数量。3、挖除病株。凡新植树木,若在当前生枝上发现有1～3个枝感源,即应彻底挖除,另行更     

土壤中磷钾含量之比值与泡桐丛枝病之间的关系(摘要)

1982年4～7月,我们对陕西、河南、甘肃、四川等省的18个县(市)的泡桐丛枝病发生情况与环境因子关系进行了调查,并对调查的土壤资料,用通径分析的方法进行了研究。结果发现土壤中磷、钾含量之比值(P/K)与泡桐丛枝病感病指数成负相关。即磷含量愈高,发病愈轻,含量愈低,发病愈重,钾的影响与此相反。这就为泡桐丛枝病的防治提供了新的途径。1965年以来,陕西省的渭南、蒲城等县,先后从河南引种了大量的兰考桐,使泡桐在陕西有了很大发展。随着泡桐的发展,丛枝病(MLO)也日益严重,给生产带来了很大威胁。目前,对泡桐丛枝病国内外都在研究,但对该病发病规律还不够了解。有的资料记载与土壤有关,但关系的焦点却不清楚。有     

重阳木丛枝病类菌原体（MLO）传染长春花的研究

重阳木丛枝病普遍发生在我国南方各省,尤其安徽、湖北一些地区危害严重。1983年作者用电镜证实了重阳木丛枝病为类菌原体病害。本病在国外尚无报道。在传病试验中证实了感病植株病皮能嫁接传病。树木感染MLO病害后,其病原在感病植株中分布局限且浓度较低。长春花是多年生草本植物,植物MLO病原能在长春花内大量繁殖,成为研究树木MLO病害的理想试验植物。1988年试验证实泡桐丛枝病MLO病原可由南方菟丝子传染到长春花上,表现典型丛枝黄化及花变叶病状。本文将报道用南方菟丝子传染重阳木丛枝病MLO到长春花上,并回接成功。     

基于cpDNA rps16序列分析兰考泡桐与白花泡桐和毛泡桐的遗传关系

【目的】通过测序法分析兰考泡桐与白花泡桐和毛泡桐在叶绿体rps16序列上的遗传差异,旨在分析三者之间在叶绿体基因上的变化特点和规律,探讨其种间的遗传关系。【方法】选取兰考泡桐、白花泡桐和毛泡桐各15个样本,对其提取的DNA用PCR扩增获得特异片段,并将其纯化与测序。利用软件Clustal X 2.0对所得序列进行排序;运行MEGA 4软件,进行多序列比对,分析其序列特征,并计算出K2P遗传距离。【结果】(1)对获得的rps16序列进行测定分析,得兰考泡桐序列长度分别为932 933 bp;白花泡桐序列长度为932 bp;毛泡桐序列长度分别为916918 bp。对所得rps16序列进行排序后的长度为938 bp,平均GC含量为34.31%。3个种所代表的个体之间共有10个变异位点,占整个序列长度的1.07%。其中有9个变异位点属于碱基插入或缺失类型,占变异位点总数的90%,占整个序列长度的0.96%。有1个变异位点属于碱基替换类型,占整个变异位点总数的10%,占整个序列长度的0.11%。(2)整个rps16片段的序列共有10个变异位点,其中兰考泡桐与白花泡桐在总的变异位点上,具有一致的碱基位点9个,占总变异的90%。而兰考泡桐与毛泡桐相比,没有相同的碱基。【结论】根据三种泡桐的rps16序列的序列特征和变异位点的分析,表明在叶绿体遗传方面,兰考泡桐具有与白花泡桐更多相似的遗传物质,其亲缘关系较近。综上所述,推测兰考泡桐与白花泡桐可能来自同一母系遗传。