皮蝇Hypodermin A基因的克隆及表达质粒构建

参照牛皮蝇Hypodermin A（HA)基因的核苷酸序列．设计一对引物．以皮蝇总RNA为模板进行RT--PCR扩增牛皮蝇HA基因．将扩增基因进行克隆测序。序列分析表明．所克隆获得的基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97．2％和99．3％。同时．将该基因与表达载体PGEX-4T-1连接．构建并获得阳性重组表达载体。     

皮蝇Hypodermin A基因的克隆及表达质粒构建

参照牛皮蝇HypoderminA(HA)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以皮蝇总RNA为模板进行RT--PCR扩增牛皮蝇HA基因,将扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,所克隆获得的基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.2%和99.3%。同时,将该基因与表达载体PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。     

牛皮蝇Hypodermin B 基因的克隆及原核表达载体构建

参照牛皮蝇Hypodermin B(HB)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以牛皮蝇总RNA为模板利用RT—PCR扩增牛皮蝇HB基因,并对扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,克隆的牛皮蝇HA基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97．2％和99．3％。同时,将该基因与原核表达载体．PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。     

纹皮蝇HypoderminC基因真核表达质粒构建及小鼠免疫试验

根据GenBank发表的Hypodermin C(HC)基因序列设计引物,以原核表达载体pET-HC为模板,PCR扩增HC基因,将克隆基因插入到真核表达载体pVAX1中,构建重组真核表达质粒pVAX1-HC。将重组质粒pVAX1-HC转染小鼠胎儿成纤维细胞,以间接免疫荧光法检测HC基因在细胞中表达。用真核表达质粒pVAX1-HC经双侧胫前肌注射昆明小鼠,对小鼠进行体液免疫和细胞免疫研究。结果表明,小鼠血清抗体水平和淋巴细胞增殖水平明显高于非免疫对照组。本研究成功构建了真核表达质粒pVAX1-HC,为纹皮蝇核酸疫苗研发奠定了基础。     

皮蝇素A基因的克隆及其毕赤酵母表达载体的构建

提取采自甘肃玛曲皮蝇一期幼虫的总RNA,合成cDNA,根据设计的特异引物,利用PCR技术扩增出皮蝇素A(Hypodermin A,HA)基因片段,用Xho Ⅰ、Xba Ⅰ消化,将消化后的目的基因HA纯化并回收,与经同样的酶消化后并纯化回收的裁体pPICZa连接并转化,获得重组表达质粒pPICZa-HA,经PCR、酶切、测序表明,目的基因插入位置、方向和阅读框正确.     

纹皮蝇Hypodermin C基因原核表达及间接ELISA检测方法的建立

为建立牛皮蝇蛆病的抗体检测方法,本研究从纹皮蝇I期幼虫中提取总RNA,采用RT-PCR扩增了Hypodermin C(HC)基因.将该基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+)中进行原核表达.获得了31ku以包涵体形式表达的重组HC蛋白.Western blot结果表明表达产物能够与阳性牛血清IgG特异性结合,具有良好的抗原活性.以纯化的重组HC作为包被抗原建立了牛皮蝇蛆病间接ELISA诊断方法,实验确定抗原最佳包被浓度为15.63 μg/mL,血清最佳稀释度为1:80,阳性标准判定为待检血清OD值＞0.256.所建立的诊断方法具有较好的特异性、敏感性和可重复性.应用该检测方法对230份临床血清进行检测,阳性率为20.6％.研究结果表明该间接ELISA方法是一种有效的牛皮蝇蛆病血清学检测方法.     

HypoderminC基因DNA疫苗的构建及其免疫原性试验

本试验以Hypodermin C(HC)基因原核表达载体pETHC为模板,PCR扩增HC基因,克隆测序后,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了DNA疫苗pcDNA-HC。pcDNA-HC体外转染小鼠胎儿成纤维细胞后,间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达。以DNA疫苗pcDNA-HC免疫小鼠,对小鼠进行体液免疫水平检测。结果表明,所构建的DNA疫苗能转染到小鼠胎儿成纤维细胞中并正确表达,免疫小鼠血清IgG滴度随免疫次数的增加而升高。     

phyA基因的克隆及其新型表达载体的构建

直接以黑曲霉菌株F246基因组为模板，对植酸酶基因phyA的成熟肽(分子长度为1347bp)进行了PCR扩增，再将PCR产物克隆入pMD18-T质粒，经DNA测序鉴定正确后，亚克隆入表达载体pET30a^ 和pMG36e，成功构建了phyA基因2种新型表达载体。植酸酶phyA基因2种新型表达载体的构建，为进一步获得大量、高活性植酸酶以及研究和开发新型微生态制剂打下了基础。     

K88-ST融合基因的克隆及真核表达载体的构建

利用DNA重组技术，将编码K88-ST融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pCAMBIA 1302中，成功的构建了植物重组表达质粒pCAMBIA-K88-ST。并将其转化农杆菌EHA105，为K88-ST基因的进一步研究奠定基础。     

K88-ST融合基因的克隆及真核表达载体的构建

利用DNA重组技术,将编码K88-ST融合基因的序列片段克隆到植物表达载体pCAMBIA1302中,成功的构建了植物重组表达质粒pCAMBIA-K88-ST。并将其转化农杆菌EHA105,为K88-ST基因的进一步研究奠定基础。     

高羊茅黔草1号SAMDC基因的克隆及植物表达载体的构建

采用高保真平末端法从高羊茅黔草1号（Festuca arundinacea cv. Qiancao No. 1）叶片cDNA中扩增S 腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因（SAMDC）序列。基因测序分析表明,扩增片段含有1 835个核苷酸,包含有9 bp的微型上游阅读框、147 bp的小型上游阅读框和1 185 bp的主阅读框。微型上游阅读框和小型上游阅读框存在一个碱基重叠,主阅读框编码395个氨基酸。整个克隆片段与GenBank上注册的高羊茅FaSAMDC基因的核苷酸同源性为95.05%,编码氨基酸的同源性为98.22%。利用KpnI和PstI酶切位点将该片段插入到经贵州省草业研究所分子生物学实验室改造过的pCAMBIA1300植物表达载体的多克隆位点内,经琼脂糖凝胶电泳检测、酶切鉴定和序列测定,获得具有SAMDC基因和潮霉素抗性基因的适合于单子叶植物遗传转化的表达载体pCAM-SAMDC。通过冻融法将构建的重组质粒导入根癌农杆菌GV3101和EHA105感受态细胞中,并通过PCR反应对所获得的工程菌株进行鉴定,为进一步通过农杆菌介导法培养抗逆禾草新材料奠定了基础。     

牛皮蝇Hypodermin A基因在大肠杆菌中的表达

从牛皮蝇Ⅱ期幼虫中提取总RNA,进行RT-PCR扩增牛皮蝇Hypodermin A基因.将扩增基因进行克隆测序,构建原核表达栽体pET30-HA,转化大肠杆菌BL21(DE3).用IPTG诱导表达,得到表达量达到全菌蛋白35%以上的特异性蛋白.SDS-PAGE分析表明,表达产物大部分以包涵体形式存在.Western-blot检测结果表明,获得的重组蛋白为重组Hypodermin A,具有较好的免疫活性.     

LacS基因原核表达载体构建及重组蛋白表达

克隆得到硫矿硫化叶菌中的糖苷酶基因LacS,利用原核表达载体pASK-IBA-2构建重组质粒pASK-IBA-2-LacS,酶切和测序鉴定证实LacS基因成功插入且基因阅读框正确。重组质粒pASK-IBA-2-LacS转化大肠杆菌Rosseta,去水四环素诱导后,菌液裂解离心亲和层析获得重组蛋白,western blot证实LacS在大肠杆菌Rosseta能高效表达。     

口蹄疫病毒P1 2A和3C基因重组逆转录病毒表达载体的构建

以A型口蹄疫病毒（FMDV）AV88（L）和XJ99株的P12X基因和AV88（L）3C基因的阳性克隆质粒为模板，用PCR扩增各基因片段，酶切后分步定向亚克隆至逆转录病毒表达载体pBABE-puro上经PCR、酶切鉴定及测序。结果表明，获得了2个含不同RGD基序的A型FMDV衣壳蛋白和蛋白酶基因的重组逆转录病毒表达载体pBABE-AV88（L）P1 2X3C和pBABE-XJ99 P1 2X3C，为研究安全、高效、低成本的FMDV空衣壳亚单位疫苗奠定了基础。     

膜联蛋白B2基因的克隆及其真核表达载体的构建

根据GenBank已登录的猪囊尾蚴膜联蛋白B2基因序列,设计合成1对特异性引物,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从猪囊尾蚴中扩增出膜联蛋白B2基因,将其克隆至pcDNA3.1表达载体上,经酶切鉴定和基因测序表明,目的基因AnnexinB2已正确地整合至表达质粒中,成功构建了膜联蛋白B2基因的真核表达载体.     

牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因（Follistatin,FSTN）基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结...     

轮状病毒VP4基因和VP7基因原核表达载体的构建及表达

经PCR从含有VP4基因、VP7基因片段的重组质粒pT-VP4和pT-VP7中护增VP4、VP7基因，连接至pGEM-5zf( )。经筛选和鉴定正确后同时酶切目的基因和表达质粒pET-28a( )，连接、转化受体菌，经PCR、酶切和序列分析证明，连接向位和阅读框架是正确的，从而构建了轮状病毒保护性抗原VP4基因、VP7基因片段的原核表达载体pET28a-VP4、pET28a-VP7。重组质粒转化表达菌在IPTG诱导下，用SDS-PAGE、薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明，表达的目的蛋白以包涵体的形式存在，蛋白的分子量分别为37.69和36.20ku，表达量占菌体总蛋白的比例分别为17.1%和14.4%。     

微小牛蜱Bm86基因的克隆及真核表达载体的构建

为了克隆微小牛蜱Bm86基因及构建该基因的表达载体，以微小牛蜱饥饿幼蜱的破解物提取的总RNA为模板，参照已发表的微小牛蜱Bm86基因的核苷酸序列，设计了1对引物，采用RT—PCR技术获得微小牛蜱Bm86基因；将Bm86基因克隆入载体，并进行序列分析，结果证明，克隆的Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因序列的同源性达97．4％，而且该序列包含完整的开放阅读框。将该基因克隆入真核表达载体pPIC9K，构建并获得了重组真核表达载体pPIC9K—Bm86。     

无芒隐子草CsLEA基因超表达载体和反义表达载体构建

根据已克隆出的无芒隐子草(Cleistogenes songorica)晚期胚胎发生丰富蛋白基因CsLEA(GenBank序列号为FJ972827)基因和植物表达载体的酶切位点特征, 分别将CsLEA基因编码区序列480 bp正向和反向插入pBI121, 构建了超表达载体pBI121 35S::CsLEA和反义表达载体pBI121 35S::AS-CsLEA。电击法转入根癌农杆菌GV3101中, 并通过花粉管通道法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana), 经卡那霉素抗性筛选和PCR鉴定, 已获得T1代阳性植株。     

家蚕杆状病毒载体构建及外源基因的表达

本文介绍了杆状病毒载体构建方法,分析了影响外源基因表达效率的因素,概述了近年来家蚕杆状病毒栽体在蚕体内表达外源基因产物所取得的成绩,并指出了这一系统存在的问题,提出了改进意见.