鸭肝炎病毒地方株VP1基因的序列测定及分析

从湖北某发病鸭场分离到一株鸭肝炎病毒DHV/HB98,通过RT-PCR方法扩增该毒株的VPI基因的核苷酸序列.系统发育分析表明,DHV/HB98株的基因组序列与已发表的DHV-1 E53和ZJ的结构基因VP1亲缘关系最近,核苷酸的同源性为98.6％和98.3％,氨基酸序列的同源性为98.3％和98.7％,分析DHV/HB98与发表的变异株90D和04G核苷酸同源性为65.4％和66.7％,氨基酸同源性为69.5％和74.8％.推断该毒株属于DHV-1,与变异株是不同的血清型;DHV/HB98与DHV-1 ZJ具有相近的遗传关系,推断DHV/HB98也为强毒株.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒RNA聚合酶基因的克隆及原核表达

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV-Ⅰ）ZJ-Ⅴ株基因组序列（GenBank登录号：EF382778）,设计了一对扩增RNA聚合酶基因（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）的特异性引物,以ZJ-Ⅴ株基因组为模板,扩增DHV-Ⅰ的RdRp基因。运用DNAStar软件对ZJ-Ⅴ株病毒与GenBank上已发表的其他不同DHV毒株的RdRp基因序列进行同源性比较和遗传进化分析,结果表明,ZJ-Ⅴ株与A型DHV-ⅠR85952株（DQ226541）的同源性为97.1%,亲缘关系最近,与2株台湾新型（B型）DHV之间为76.9%和77.0%,与C-GY株和4株韩国新型（C型）DHV株之间为76.2%~76.5%,亲缘关系较远。将RdRp基因克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,获得重组表达质粒pET-RdRp,转化宿主菌E.coli BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示RdRp蛋白分子量约为65 kDa,Western blot检测证明RdRp蛋白能与Ⅰ型鸭病毒性肝炎阳性血清产生特异性免疫反应,具有良好的免疫学活性。本文为进一步研究DHV-Ⅰ的复制机理奠定了基础。     

鸭肝炎病毒的分离与鉴定

1999-2008年从山东、河南、浙江、江苏、广西、山西、江西、广东、福建和辽宁等地有典型鸭病毒性肝炎症状的病死雏鸭中共分离得到22株病毒。用鸭肝炎病毒（DHV）Ⅰ型（DHV-1）抗血清和新型DHV （N-DHV）抗血清对分离的22株病毒进行血清中和试验;对22株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,然后对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列进行分析。结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种血清型。其中分离到的12株为DHV-1,10株为N-DHV。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。12株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,10株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%-77%。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。     

Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒双重RT-PCR检测方法的建立与优化

为了快速鉴别诊断Ⅰ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒(DHV),根据NCBI中发表的DHV毒株序列设计2对特异性引物,针对西南大学荣昌校区疾病快速诊断中心保存的DHV-Ⅰ型和DHV-Ⅲ型毒株进行了RT-PCR双重检测方法的建立及条件的优化试验。结果表明:所建立的方法可同时对两种血清型的DHV分别扩增出440 bp和642 bp的特异性条带,灵敏性可以达到18.7×10-1ng/μL;利用该方法对鸭瘟病毒、小鹅瘟病毒、鸭圆环病毒、番鸭细小病毒、鸭副黏病毒、新型鸭肝炎病毒进行扩增,扩增结果均为阴性。说明所建立的双重RT-PCR检测方法特异性好,具有较高的灵敏性,可用于DHV-Ⅰ型和DHV-Ⅲ型的鉴别诊断。     

一株Ⅰ型鸭肝炎病毒全基因组序列分析

为了研究Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)遗传变异情况,试验采用全基因组序列测定的方法对广东省佛山地区分离到的1株Ⅰ型鸭肝炎病毒进行分析研究。结果表明:不含poly(A)尾的DHV-Ⅰ基因组全长7 690 bp,只含有1个开放阅读框(ORF),编码2 249个氨基酸;将此病毒株与GenBank公布的其他DHV全基因序列进行序列分析,VP1蛋白变异最大,180～220位为高变区,与DHV-Ⅰ参考毒株核苷酸序列同源性在94.0%～97.4%之间,氨基酸序列同源性在97.5%～99.2%之间;对此病毒株进行遗传进化分析,与DHV-Ⅰ参考毒株处于同一分支,与韩国和中国台湾省新型鸭肝炎病毒处于不同分支。     

鸭肝炎病毒分子流行病学分析

为了解我国鸭病毒性肝炎(DH)的流行情况,本研究用标准DH病毒(DHV)Ⅰ型(DHV-1)抗血清和新型DHV(N-DHV)抗血清对国内分离的7株DHV进行了血清中和试验。结果表明,PLK株和YB3株为DHV-1;YB1、YB2、YB5、HY2和HY3株为N-DHV。同时,对国内分离的9株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列分析的结果表明,3株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,6株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%～77%。参照同属微RNA病毒的人肠病毒的血清型分型标准,通过对DHV VP1基因序列同源性比较,判定9株病毒的血清型。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。同型不同毒株间VP1基因的差异可以导致病毒在致病力、细胞感染能力等方面的差异。研究结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种独立的血清型,但尚未见血清亚型的流行。     

新型鸭肝炎病毒全基因组序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(DHV)基因组变异情况,本研究将广东地区分离到的1株,山东地区分离到的2株与1型DHV(DHV-1)无抗原交叉性的新型DHV(N-DHV)全基因组序列测定的结果进行了分析。结果表明,N-DHV基因组全长7786nt～7788nt,仅有一个ORF,其结构具有典型的微RNA病毒科病毒基因组特征。ORF编码一个2251aa的聚合蛋白,该蛋白经3Cpro切割产生3个结构蛋白(VP0、VP3、VP1)和8个非结构蛋白(2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D)。与其他N-DHV毒株及DHV-1的抗原性相关VP1蛋白氨基酸序列比对表明,3株病毒之间及与国内分离的N-DHVG株的同源性均在98%以上,与韩国N-DHV同源性均大于92%,与中国台湾地区N-DHV同源性为80.1%～80.9%,与DHV-1的同源性为76.9%～77.3%。3株病毒与韩国N-DHVVP1氨基酸差异位点主要集中在C-端的高变异区。依据微RNA病毒科人肠病毒属血清型分型标准,GD株、SD01株、SD02株与韩国N-DHV和G株属于同一血清型,而与DHV-1和中国台湾地区新型DHV属于不同的血清型。     

鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术及RACE方法扩增得到鸭肝炎病毒(DHV)浙江分离株Z10的全基因(5',3'末端序列用RACE法扩增)及4株DHV分离株的VP1基因.结果表明,分离株Z10的全基因片段长7689 bp,有1个大的开放读码框(ORF),ORF位于626～7326位核苷酸,编码2249个氨基酸.Z10分离株全基因序列与GenBank登录的6株具有代表性的DHV核苷酸序列比对,同源性94.5%～98.4%;所测得的DHV分离株的VP1基因的序列与目前GenBank上发表的具有代表性的DHv-Ⅰ VP1基因进行比对分析,结果4株Ⅰ型DHV的VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸.4株DHV-Ⅰ之间VP1基因的核苷酸序列同源性为93%～99.7%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;与参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为92.2%～100%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,属于同一基因群.     

Ⅰ型鸭肝炎病毒的分离与鉴定

利用I型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组的5′端UTR附近区域设计1对引物,以病死鸭肝组织悬液、鸭胚尿囊液毒和鸡胚尿囊液毒为模板,RT-PCR扩增得到336 bp基因片段。经测序分析病死鸭分离病毒与已发表鸭病毒性肝炎DHV-Ⅰ型病毒的基因同源性可达98%,该病毒与已知DHV-Ⅰ毒株之间病毒基因组一级结构有较高的同源性。为进一步验证所分离的病毒为Ⅰ型鸭肝炎病毒,依据Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因特异性引物进行PCR,得到714 bp左右目的片段,证明该病毒为鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒。     

鸡传染性支气管炎病毒AH1/15株S1基因的克隆与序列分析

2015年1月从安徽省某疑似患鸡传染性支气管炎鸡场中分离到一株鸡传染性支气管炎病毒,命名为AH1/15株,使用特异性引物对AH1/15分离株S1基因进行扩增、克隆及序列测定,并将其与国内外流行株及参考毒株进行比对。结果显示,IBV AH1/15株S1基因全长为1638 bp;同源性分析结果发现,AH1/15株与国内外疫苗毒株核苷酸同源性为57.0%~59.6%;遗传进化分析结果发现,AH1/15株与国内外主要疫苗株以及流行的LX4型毒株亲缘关系较远,与近几年国内分离的CK/CH/GX/NN11-4、CK/CH/GD/CG11、CK/CH/SD09/005等毒株亲缘关系最近。结果表明,AH1/15是一株不同于疫苗株和流行株的变异株。     

广西猪瘟流行毒株E2基因的序列分析

对从广西南宁和柳州分离的2株猪瘟病毒E2基因进行了测序。应用DNAstar序列分析软件对所测2个毒株GXNN、GXLZ的E2基因序列与猪瘟兔化弱毒株和石门(Shimen)株进行了比较分析。结果显示，GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株核苷酸序列的同源性分别为82．1％和82．6％，推导氨基酸序列的同源性分别为87．9％和88．7％；GXNN、GXLZ株与Shimen株核苷酸序列的同源性分别为83．6％和84．0％，推导氨基酸序列的同源性分别为89．3％和90．1％。GXNN、GXLZ株与猪瘟兔化弱毒株和Shimen株的核苷酸序列和氨基酸序列都有明显差异。     

鸭肝炎病毒Js株VP1基因克隆及序列分析

摘要：通过PCR技术,从自行分离的鸭肝炎病毒Js株基因组中扩增出病毒衣壳蛋白VP1完整基因片段,并对该片段进行序列测定及分析。结果显示Js—VP1与DHV—A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92．7％～99．7％之间,与DHV—B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在58．5％～58．7％之间,与DHV—C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在61．6％-63．9％之间,分析表明Js株为鸭肝炎病毒基因A型,血清型分型为血清1型。进化树表明Js株与E53、X、R、AV2111株的亲缘关系较进。     

2007～2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VP1基因变异分析

为了分析华南地区鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)的遗传进化情况,本试验对2007～2009年华南地区各鸭场发病雏鸭进行DHV的病原学检测以及VP1基因扩增、克隆和测序,并运用生物信息学软件对VP1基因进行了序列分析。结果表明:所分离的R、SS1、ZJ株为DHV-A、VP1 DHV-A参考毒株核苷酸序列相似性分别为93.8%～100%、93.7%～99.6%、91.7%～98.9%,氨基酸序列相似性分别为94.5%～100.0%、94.1%～99.2%、95.0%～99.2%。其余15株DHV-C分离病毒株与台湾新型DHV核苷酸和氨基酸序列相似性均在71.4%～72.0%和78.2%～79.0%之间,与韩国新型DHV相似性在94.0%～95.1%和91.6%～93.3%之间,与国内分离的新型DHV相似性均在97.9%～100.0%和97.5%～100.0%之间。VP1氨基酸序列比对分析表明:VP1的高变区主要分布在46～64、95～149、180～223位,尤其是C′末端,存在点突变或连续变异。在第145～146位,15株新型DHV毒株比3株Ⅰ型DHV多2个氨基酸(G和G)。小RNA病毒科的VP1蛋白中保守的RGD基序,在DHV中分别显示为SGD和QSD。结果表明,危害华南地区鸭场的DHV已经发生变异,且存在两种基因型毒株的流行。     

番鸭源鸭肝炎病毒CH12株的分离与全基因组序列分析

从浙江省某疑似鸭病毒性肝炎的发病番鸭群分离到1株鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）CH12株,分离毒株经动物回归试验、ELD50测定、中和试验等确定为DHV-1（基因A型DHV）。通过RT-PCR方法对DHV CH12株的全基因组序列进行分段扩增并测序。结果表明,CH12株的全基因组长度为7690 bp（不包括PolyA）,包括626 bp的5′UTR,6747 bp的ORF和317 bp的3′UTR。CH12株各基因均与基因A型DHV毒株的序列相似性较高,与基因B型和基因C型DHV毒株的序列相似性较低。全基因组核苷酸、多聚蛋白、VP0、VP3、VP1、2C和3D基因的进化分析均显示,CH12株均与基因A型DHV在同一进化分支上,亲缘关系较近,属于基因A型DHV。     

鸭肝炎病毒GD株的全基因组序列测定与分析

为了给在分子水平上研究鸭肝炎病毒(DHV)的致病机理奠定基础,进一步丰富DHV的遗传变异和进化信息,试验采用RT-PCR方法分段克隆获得DHV-1 GD株的全基因组序列并进行序列分析。结果表明:GD株的基因组全长7 690 nt[不含Poly(A)尾],5’端和3’端非编码区长度分别为626 nt和314 nt,单一开放阅读框架(ORF)为627～7 376 nt,编码2 249个氨基酸;GD株与DHV-1参考株比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.8%～99.7%和97.7%～99.6%;与中国台湾和韩国新型DHV(DHV-N)相比同源性分别为72.7%～73.2%和81.8%～83.4%;GD株与DHV-1参考株遗传进化关系较密切,处于同一分支,而与DHV-N遗传关系较远,处于不同分支。     

鸭肝炎病毒GD株的分离与RT-PCR鉴定分析

本研究分离了1株鸭肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV),并对其进行了分型研究。取广东某鸭场疑似DHV致死8日龄雏鸭肝脏,肝脏组织处理后经鸭胚接种分离纯化病毒。分离毒株经动物回归试验、ELD₅₀测定、中和试验等确定为血清Ⅰ型DHV,同时通过RT-PCR检测及序列分析,从基因分型角度也验证分离毒株为DHV-Ⅰ,并将该分离毒命名为GD株。     

鸭坦布苏病毒GX150829株的分离鉴定与E基因的序列分析

对广西桂林某养鸭场种鸭群疑似发生鸭坦布苏病毒(DTMUV)感染的临床病例进行RT-PCR检测,病毒分离培养及血凝试验、ELD50测定和动物回归试验;对获得的分离株E基因进行扩增、序列测定与分析。结果表明:从临床组织样品与分离培养的鸭胚尿囊液中均扩增到DTMUV的特异性目的条带;分离毒株无血凝活性,鸭胚第三代尿囊液病毒的ELD50为10-4.6/0.2 m L,分离毒株引起攻毒的雏鸭发病和死亡,发病率和死亡率分别为80%和16%。表明成功分离到一株病毒,命名为GX150829株。E基因的序列分析显示,该分离株与国内DTMUV各地分离株的核苷酸同源性均高于96.5%,与BYD-1、YY5、FS、ZJ-6等参考毒株处于同一较大分支,但单独形成一个小分支,具有遗传进化研究价值。     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。     

1株传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)的分离与鉴定

将虹鳟鱼苗研磨过滤除菌后接种到胖头鱼肌肉细胞系(FHM)后出现了特征性病变(CPE),电镜下观察到IHNV病毒粒子。用传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)和传染性胰腺坏死病病毒(IPNV)等水生动物病毒特异性引物对该毒株进行RTPCR试验,结果显示,用IHNV的引物能扩增出阳性片段。将分离株暂时命名为CJ-13。应用DNAStar和MEGA5.2软件,将CJ13的N基因与多株GenBank中已发表的IHNV毒株相应基因进行同源性比对和构建系统树。核苷酸同源性显示CJ-13株与HV7601株的N基因同源性高达97.1%,推导出的氨基酸序列同源性为95.2%。系统进化树表明,CJ-13分离株与HV7601株遗传进化关系较近,属于同一分支。     

黑龙江省鸭肝炎病毒HD—Ⅰ株的分离与鉴定

从黑龙江省某鸭场疑似鸭病毒性肝炎(DVH)的发病雏鸭肝等组织中分离到1株病毒HD—Ⅰ株。经病理学检查、电镜观察、鸭胚中和试验、雏鸭保护试验、动物回归试验等鉴定为血清Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV)。证实引起该鸭场雏鸭发病和死亡的主要原因为DVH所致。用DHV标准R85952毒株多次强化免疫健康鸡，获得高效价的鸡抗鸭肝炎超免疫抗体。